Matériels et méthodes
2 VECTORISATION DU REPLIEMENT D’UNE PROTEINE IN VITRO Comme cela a été rappelé en introduction, le chemin de repliement cotraductionnel d’une
2.1 Production de solutions polyclonales d’anticorps 1 Conception des peptides épitopes
L’objectif est de choisir des sections de séquence recouvrant la majeure partie de Tox62. Pour concevoir ces peptides nous avons choisi une longueur de séquence de 10 à 15 résidus qui correspond à une taille légèrement supérieure à la longueur habituellement observée pour les épitopes continus qui est comprise entre 6 et 10 résidus ((Van Regenmortel, 2001)). Les cystéines de la toxine sont remplacées dans les peptides par des sérines afin d’éviter la formation de dimères lorsqu’ils sont en solution. De plus, la substitution par une sérine doit permettre de mimer la présence d’une cystéine réduite. La seule différence entre une sérine et une cystéine libre est le remplacement de la fonction thiol par une fonction alcool. Les anticorps induits par ces peptides doivent reconnaître la forme dénaturée de la toxine ; ces peptides ont donc été choisis de sorte que leur séquence ne recouvre pas d’élément de structure secondaire qui pourraient avoir tendance à se structurer (comme deux brins d’un même feuillet β). En effet, l’immunisation par un peptide étant capable d’acquérir une structure intrinsèquement conduirait à la production d’anticorps reconnaissant cette structure et non la forme dépliée. Toujours pour éviter une structuration proche de la forme oxydée de la protéine, le peptide ne doit pas recouvrir deux cystéines d’un même pont.
Résultats
114 2.1.1.1 Les anticorps obtenus
Le premier jeu de peptides utilisés pour produire nos anticorps sont ceux présentés sur la Figure 42. Pour chacun des anticorps reçus, une expérience de titrage en ELISA a été réalisée afin de vérifier l’existence d’une liaison avec l’antigène polyS (Figure 43).
Les anticorps anti pTx1 ont soit une affinité très faible, soit sont en très faible quantité. Quelle que soit la raison de ce faible titre, cette solution d’anticorps ne sera pas utilisée pour la suite de la caractérisation. Les sérums obtenus à partir du peptide pTx4 n’ont montré aucune activité de liaison spécifique.
pTx 1 pTx 2 pTx 3 pTx 4
LECHNQQSSQPPTTKTCSPGETNCYKKVWRDHRGTIIERGCGCPTVKPGIKLNCCTTDKCNN
Figure 42 : A , Structure cristallographique de Tox62. Les couleurs vert, cyan, orange et bleu correspondent aux épitopes des anticorps pTx1, pTx2, pTx3 et pTx4 respectivement. B , séquence des peptides épitopes.
A
B
N
Résultats
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A
B
acpTx1 acpTx2 acpTx3
Titre moyen : 10 1900 500
Figure 43 : A , Courbes de titrage obtenues pour les solutions brutes des anticorps anti pTx1, pTx2 et pTx3 avec polySC-biot (lié à la streptavidine immobilisée sur la plaque). B , Titres moyens obtenus avec 4 expériences de titrage par liaison sur polySC-biot immobilisé.
Log10(dilution) D O ( si g n al s p éc if iq u e)
Résultats
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Ne disposant que de deux anticorps (acpTx2 et acpTx3), une autre série de peptides a été utilisée pour produire une deuxième série d’anticorps. Afin d’augmenter les chances d’obtenir un anticorps spécifique de la partie C-terminale, indispensable pour réaliser la vectorisation, la séquence de Tox62 a été rallongée par un peptide connu pour être immunogène. La séquence Etag a été choisie ((Lampugnani et al., 2006)).
A
pTx 1Bis pTx 3bis pTx 4Bis
LECHNQQSSQPPTTKTCSPGETNCYKKVWRDHRGTIIERGCGCPTVKPGIKLNCCTTDKCNN
B
pTx ETag
LECHNQQSSQPPTTKTCSPGETNCYKKVWRDHRGTIIERGCGCPTVKPGIKLNCCTTDKCNNGAPVPYPD
Figure 44 : A : Séquence des peptides utilisés pour la deuxième série d’immunisation. B : Séquence du variant Tox62Etag et du peptide pTxETag
Le peptide épitope pTxETag contient la séquence de Etag (GAPVPYPD) mais chevauche également l’extrémité C-terminale de Tox62 (DKCNN). Comme cela a été montré en partie 5.3.2.2 de l’introduction, l’asparagine 61 joue un rôle particulier dans la structure des protéines trois doigts. Il semble nécessaire qu’un anticorps devant bloquer le repliement de la partie C- terminale recouvre ce résidu. D’autre part cet anticorps devait recouvrir la cystéine 60 et donc empêcher la formation du pont 55-60.
Lorsque l’anticorps anti pTxETag est utilisé, la protéine Tox62Etag (Figure 44 B) devient le modèle d’étude. Pour que nos connaissances concernant le repliement de Tox62 soient utilisables pour interpréter les résultats obtenus avec Tox62ETag, le repliement de ces deux molécules a été comparé (Figure 45).
Résultats
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Figure 45 : Comparaison des repliements de Tox62 (1) et Tox62ETag (2) aux temps longs, suivis en HPLC-RP. 0 min 15 min 30 min 45 min 1 h 2 h 4 h 6 h 24 h 0 min 15 min 30 min 45 min 1 h 2 h 4 h 6 h 24 h
Résultats
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La comparaison des profils chromatographiques obtenus pour le repliement de Tox62 et Tox62Etag montre que le même nombre d’intermédiaires apparaît et que leur évolution est identique (Figure 45). Tox62Etag pourra donc être utilisé comme modèle du repliement de Tox62.
acpTx2 acpTx3 acpTx1bis acpTx4bis acpTxETag
Titres : 560 230 10 0 65
Tableau 10 : Titres obtenus en ELISA (polySETag directement immobilisé) pour la deuxième série d’anticorps.
AcpTx2 et AcpTx3 sont ici utilisés comme référence. Leurs titres sont respectivement 3,4 et 2,2 fois inférieurs à ceux présentés sur la Figure 43 B. Cette différence peut être expliquée soit par le changement d’antigène soit par le changement de mode d’immobilisation. En effet, dans le cas du Tableau 10, l’antigène polySETag a été directement immobilisé sur la plaque alors que pour la Figure 43, l’antigène polySC-Biot est lié par sa biotine C-terminale à la streptavidine immobilisée sur la plaque. Dans le premier cas les antigènes sont adsorbés dans des configurations aléatoires sur la plaque ; dans le deuxième cas, l’antigène est immobilisé par la partie C-terminale et la partie N-terminale est orientée vers le solvant. Les autres valeurs de titre du Tableau 10 doivent donc être comparées à celles de acpTx2 et acpTx3 dans ce même tableau.
Enfin une troisième série d’anticorps a été commandée à la société PROTEOGENIX.
acpTx2 acpTx3 acpTx3Ter acpTxETag’ Titres : 560 230 << 100 15000
Tableau 11 : Titres obtenus en ELISA (polySETag directement immobilisé) pour les anticorps fournis par la société PROTEOGENIX
2.1.1.2 Conclusion
Pour la suite de l’étude seuls les anticorps disposant d’un titre supérieur à 50 ont été retenus. Seuls les anticorps anti pTx2, antipTx3, antipTx3Ter, anti pTxETag et anti pTxETag’ seront étudiés.
Il faut souligner que les anticorps anti pTx2, anti pTx3 et anti pTxETag ont été fournis par l’équipe de Marcoules. Une précipitation à l’acide caprylique a été effectuée avant l’envoi.
Anti pTx3ter et anti pTxETag’ nous ont été fournis par la société PROTEOGENIX, sous forme d’un sérum. Pour obtenir une solution d’immunoglobuline G, nous avons purifié ces sérums sur colonne d’affinité à la protéine A (voir partie 4.2 des matériels et méthodes). Les caractérisations ultérieures correspondent aux solutions purifiées.
Enfin, la solution d’anticorps anti pTxETag fournie par Marcoules ayant un titre de 65 a été purifiée par chromatographie d’échange d’ions pour être ensuite concentrée sur tube Vivaspin. Ce sont les anticorps de cette solution concentrée que l’on appellera par la suite acpTxETag.
Résultats
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2.1.2 Mesure de la concentration en anticorps actifs, étude en Biacore
Dans l’optique de réaliser la vectorisation du repliement, il est nécessaire de se placer en excès en anticorps actifs par rapport à la toxine réduite pour que toutes les molécules de toxine subissent l’action des anticorps. Nous avons donc besoin de déterminer la concentration en anticorps actifs dans les solutions d’anticorps dont nous disposons. Ces solutions d’anticorps sont toutes des mélanges polyclonaux. Il convient de noter qu’une solution polyclonale d’anticorps contient des anticorps pouvant présenter des affinités hétérogènes, en conséquence il est probable que toutes les molécules de toxine ne se lient pas de la même façon aux anticorps. On se propose ici de déterminer une concentration équivalente en assimilant le mélange polyclonal à une solution pure d’anticorps d’affinité homogène (Tableau 12). Par la suite, un excès d’anticorps par rapport à la toxine sera utilisé afin de palier à l’imprécision de cette mesure.acpTx2 acpTx3 acpTx3ter acpTxETag acpTxETag’ Concentration en
anticorps spécifiques en nM
280 110 55 000 760 2 700
Résultats
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