30’ Forme réduite
2.3.2 Contrôle du repliement par action des anticorps
Dans le but de réaliser la vectorisation du repliement, il est nécessaire que les anticorps utilisés aient un effet sur le repliement de la toxine. En présence du tampon oxydo-réducteur, ces derniers doivent inhiber la formation des ponts dans la partie de la molécule correspondant à leur épitope.
2.3.2.1 Seul acpTx2 inhibe le repliement
Suivi de l’inhibition du repliement par acpTx2, acpTx3 et acpTxETag par mesure de l’activité
L’action de acpTx2 et de acpTx3 sur le repliement de Tox62 et celle de acpTxETag sur Tox62Etag ont été testées. Les points des courbes présentées en Figure 56 ont été obtenus en calculant un pourcentage d’activité en considérant que la valeur de concentration atteinte après 24 heures de repliement en présence d’immunoglobuline G non spécifiques de lapin (Figure 56 courbes noires) correspond à 100% d’activité.
Après 180 minutes de repliement, on obtient 20% d’activité en présence de l’anticorps anti pTx2 et 70% pour l’expérience contrôle (Figure 56 1). Le repliement de Tox62 est bien inhibé par la présence de cet anticorps. A l’inverse, la cinétique de repliement de Tox62 n’est pas modifiée par la présence de acpTx3.
Une valeur d’activité supérieure à 100% est observée après 24 heures de repliement en présence d’acpTx3. Cette anomalie peut s’expliquer par le fait que la technique utilisée est peu précise. De plus, aux faibles concentrations de toxines utilisées (2nM en l’occurrence), le taux de récupération de toxine est variable. Cette variation a été attribuée à une adsorption de la toxine réduite sur les parois des tubes Eppendorf et des cônes utilisés. La présence de protéines non spécifiques et l’utilisation de cônes et de tubes silanisés (voir matériels et méthodes) ont permis de minimiser ce phénomène sans toutefois l’éliminer totalement. Cependant cette imprécision de mesure ne remet pas en cause l’observation de l’inhibition par acpTx2 car non seulement le taux de récupération est modifé (60%) mais également la cinétique d’apparition de l’activité.
Le taux de récupération de toxine Tox62ETag active en présence de acpTxETag est identique à celui obtenu dans l’expérience témoin (Figure 56 2). La cinétique d’apparition d’activité semble peu affectée par l’action de acpTxETag. Ce résultat n’implique pas nécessairement que cet anticorps ne modifie pas le repliement. En effet, étant spécifique de l’extrémité C-terminale de la toxine, il est possible que cet anticorps soit lié, qu’il empêche la formation du pont C-terminal mais que le reste de la molécule soit structuré. Dans ce cas acpTxETag inhiberait bien la formation du pont mais n’empêcherait pas la formation d’intermédiaires disposant d’une certaine activité biologique. On sait en effet que l'activité biologique de la protéine se situe essentiellement dans le bas des boucles II et III ((Tremeau et al., 1995)), donc assez éloigné de l'épitope. De plus, on a vu que les intermédiaires C et D possèdent une activité biologique. Dans le but de connaître l’effet de acpTxETag sur l’apparition des formes intermédiaires de Tox62ETag, l’étude en isoélectrophorèse semble mieux adaptée.
Résultats
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Figure 56 : 1, Repliement de Tox62 à 2nM suivi en activité biologique en présence d’immunoglobuline G non spécifiques de lapin (ronds noirs), de acpTx2 (carrés cyans), de acpTx3 (triangles oranges). 2, Repliement de Tox62 ETag à 2nM suivi en activité biologique en présence d’immunoglobuline G de lapin non spécifiques (ronds noirs) et de acpTxETag (carrés violets)
1
Résultats
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Suivi de l’inhibition du repliement par acpTx2, acpTx3 et acpTxETag par isoélectrophorèse
Les images présentées en Figure 57 confirment les résultats obtenus par mesure de l’activité. Il apparaît clairement qu’en présence de acpTx2, le repliement de Tox62ETag 35S est fortement
ralenti. En effet, après 4 heures de repliement, la bande correspondant à la forme oxydée est à peine discernable. La comparaison entre les images A et B de la Figure 57 montre que les espèces à faible nombre de ponts (proche de la forme réduite) restent présentes jusqu’au temps 24 heures ce qui n’est pas le cas dans l’expérience témoin. Outre ces espèces à faible nombre de ponts et la forme native qui apparaît après 24 heures de repliement, une bande ayant un Rf de 0,41 apparaît dès 30 minutes et reste présente même au bout de 24 heures. Comme cela a été décrit en partie 2.3.1.2 de ces résultats cette zone correspond à celle des intermédiaires à 3 ponts (le Rf des intermédiaires à 3ponts de Tox62ETag est de 0,51). Cette expérience confirme donc l’action inhibitrice de l’anticorps acpTx2 sur le repliement de Tox62ETag. Elle montre également qu’en présence de acpTx2, le repliement de Tox62ETag produit un intermédiaire disposant probablement de trois ponts disulfure mais différent de ceux se formant lorsque cette protéine se replie en l’absence d’anticorps spécifiques.
La même expérience effectuée en présence de acpTx3 montre que cet anticorps n’a d’effet ni sur la vitesse d’apparition de la forme native ni sur la composition en intermédiaires (comparer Figure 57 A et 57 C).
Lorsque le repliement de Tox62ETag est effectué en présence de acpTxETag, la cinétique d’apparition de la forme native est similaire à celle observée dans l’expérience témoin (Figure 57 A et D). Cependant la bande correspondant aux intermédiaires à trois ponts dans l’expérience témoin a dans ce cas un Rf de 0,45 (à comparer à 0,51). La présence de l’anticorps acpTxETag semble impliquer la formation d’un intermédiaire à trois ponts différent de ceux apparaissant lors du repliement sans anticorps.
Conclusions
Les deux méthode utilisées montrent que seul acpTx2 est capable d’inhiber le repliement de Tox62.
Résultats
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Figure 57 : Repliement de Tox62 ETag suivi en isoélectrophorèse en présence d’immunoglobuline G non spécifiques de lapin (A) et de acpTx2 (B) et de acpTx3 (C) et de acpTxETag (D).
A
B
0’Intermédiaires à 3 ponts
30’ 1h 2h 4h 24h 0’ 30’ 1h 2h 4h 24h 0’ 30’ 1h 2h 4h 24h 0’ 30’ 1h 2h 4h 24hC
D
Résultats
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2.3.2.2 Levée de l’inhibition de acpTx2 par ajout du peptide épitope
Le seul anticorps ayant un effet sur la cinétique de repliement de Tox62 est acpTx2. L’expérience suivante (Figure 58) permet de vérifier qu’il est possible de lever son inhibition par ajout du peptide épitope pTx2 .
Figure 58 : Repliement de Tox62 à 2nM suivi en activité biologique en présence d’immunoglobuline G de lapin non spécifiques (ronds noirs pleins), de acpTx2 (carrés cyan pleins) et dissociation de acpTx2 par ajout d’un excès de pTx2 au temps zéro (triangles bleus pleins)
L’ajout de peptide épitope au temps 0 permet d’obtenir une cinétique d’apparition de formes actives intermédiaire entre celle de l’expérience témoin et celle de l’expérience d’inhibition par acpTx2. Le taux de récupération après 24 heures dans l’expérience de dissociation est de 70% donc à peine supérieur celui obtenu dans l’expérience d’inhibition (qui est de 60%).
Il semble donc possible (au moins partiellement) de lever l’inhibition du repliement par ajout du peptide épitope.