Effet des anticorps sur le repliement de la toxine αααα

2.3.1 Méthodes d’étude de la cinétique de repliement à faible

concentration

Les résultats de la partie précédente ont montré que les solutions d’anticorps polyclonaux dont nous disposons ont des concentrations de l’ordre de la centaine de nanomolaires (voir Tableau 12 en partie 2.1.2 de ces résultats). La mesure de cette concentration étant approximative, il est nécessaire de se placer dans un excès d’anticorps, de cinq à dix fois. La méthode utilisée pour suivre le repliement doit permettre de déterminer l’avancement du repliement de la toxine α à des concentrations de l’ordre de la dizaine de nanomolaires. Deux méthodes ont été développées.

2.3.1.1 Repliement suivi par mesure de l’activité biologique
Test d’activité biologique

Afin de déterminer l’activité biologique d’une toxine, des tests de liaison ont été développés au laboratoire par l’équipe de Denis Servent (SIMPRO CEA-Saclay). Le principe de cette expérience consiste, en une compétition entre la toxine que l’on étudie et une toxine de référence marquée radioactivement, ici la bungarotoxine 125_{I. En réalisant une gamme de concentration de Tox62 on}

obtient la courbe de déplacement suivante :

Figure 52 : expérience de compétition entre Tox62 et la bungarotoxine 125_{I. Les losanges pleins}

correspondent à une incubation réalisée dans le tampon PBS+BSA0,1% alors que les losanges vides correspondent à une incubation dans le tampon de repliement.

On observe qu’entre 0,02 nM et 1 nM le signal obtenu est dépendant de la concentration en toxine (Figure 52). Cette méthode permet donc de détecter des formes de toxine biologiquement actives dans une gamme de concentration compatible avec notre objectif. Le but de l’expérience étant d’étudier la concentration en toxine active dans un mélange réactionnel de repliement il est nécessaire de vérifier que la liaison de Tox62 et de la bungarotoxine iodée ne sont pas affectées par la présence du tampon oxydoréducteur. La même gamme est obtenue dans les conditions de l’expérience de repliement. L’IC50 de Tox62 n’est pas modifié par ces conditions (Figure 52,

losange vides). Dans les deux cas il est possible de modéliser ces expériences par l’équation de l’isotherme de Langmuir.

Résultats

131 S = S0 + (ST-S0)/(1+[Tox62]/IC50)

A partir de cette équation, la concentration en Tox62 est exprimée en fonction du signal observé (S), de l’IC50, du signal maximum (ST) et du signal non spécifique (S0) :

[Tox62] = IC50 * ((ST-S0)/(S-S0) – 1)

Plusieurs expériences de compétition ont été effectuées dans ces même conditions, l’ IC50

moyen observé était de 1,6 .10-10 _M.

Lorsque le signal maximum et le signal non spécifique sont connus, il est possible de calculer la concentration en forme active de Tox62 en fonction du signal observé, grâce à la formule suivante :

[Tox62] = 1,6 .10-10 _{* ((S}

T-S0)/(S-S0) – 1)

Expérience de repliement

Une expérience de repliement oxydant de Tox62 est effectuée à une concentration de 12,5nM et est suivie en activité biologique. Dans ce cas le blocage est effectué par ajout d’une solution de iodoacétamide. L’objectif est de comparer la cinétique de repliement à faible concentration suivie en activité biologique à celle obtenue en HPLC avec une concentration de 15µM. Les résultats de ces deux cinétiques ne sauraient être comparés directement car la mesure d’activité donne une valeur globale de l’activité du mélange de repliement. Or, les formes C et D ayant une structure proche du natif, elles sont susceptibles d'avoir une activité biologique. Les IC50 des intermédiaires

C et D (bloqués à l’iodoacétamide et purifiés en chromatographie phase inverse) ont été mesurés (Tableau 13).

Tox62 Tox62 int C Tox62 int D

IC50 en nM 0,16 0,87 3,5

Tableau 13 : Mesure de l’IC50 des intermédiaires C et D de Tox62 bloqués à l’iodoacétamide.

Lorsque ces valeurs sont comparées à celles de Tox62 (1,6.10-10 _{M), C et D sont}

respectivement 5,4 et 22 fois moins actifs que Tox62. Sachant que ces intermédiaires apparaissent très tôt et en quantité importante lors du repliement, il est indispensable de tenir compte de leur présence lors de la comparaison entre les résultats obtenus en HPLC et ceux obtenus par mesure de l’activité biologique.

Dans les conditions utilisées lors de l’expérience de repliement, c’est à dire pour une concentration en protéine comprise entre 0,1 et 1nM , le pourcentage de liaison de bungarotoxine

125_{I est proportionnel à la concentration en intermédiaire C et en intermédiaire D. Il faut 5,4 fois}

plus d’intermédiaire C que de forme native pour réaliser une même inhibition et de la même façon 22 fois plus d’intermédiaire D. A partir de ce raisonnement on peut calculer une proportion équivalente de protéine active à partir des proportions des formes C, D et N obtenues en HPLC à partir de la formule suivante :

Résultats

132

Figure 53: Cinétique de repliement de Tox62 suivie en activité biologique à 12,5nM (carrés rouges) et simulation en HPLC (triangles bleus)

Conclusion

Ces résultats signifient que la vitesse de repliement est identique que la concentration en toxine soit de 12,5nM ou de 15µM (Figure 53). Par ailleurs le suivi de l’activité biologique semble être une méthode adéquate pour étudier le repliement des toxines à une concentration de l’ordre du nanomolaire.

Résultats

133 2.3.1.2 Repliement suivi par isoélectrophorèse

La méthode d’étude du repliement par mesure de l’activité biologique est certes très sensible mais ne fournit aucune information sur les formes intermédiaires qui apparaissent lors du repliement oxydant. Afin d’obtenir ce type d’information, une méthode de séparation des intermédiaires formés lors du repliement par isoélectrophorèse a été développée. Le repliement des intermédiaires dont certaines des cystéines sont libres est stoppé grâce à un agent introduisant une charge par cystéine libre (MTSBS). Cette méthode permet de séparer les espèces en fonction de leur nombre de cystéines libres.

La sensibilité nécessaire à la détection de faibles quantités de toxine a été obtenue par l’utilisation d’une toxine marquée au soufre 35. Pour n’avoir à produire qu’une seule protéine marquée, nous avons utilisé une toxine capable de se lier aussi bien à acpTx2, acpTx3 et acpTxETag, c’est à dire Tox62ETag.

Les cinétiques de repliement de Tox62 et Tox62ETag sont similaires (Figure 45 de la partie 2.1.1 des résultats). Afin de connaître le comportement en isoélectrophorèse des formes apparaissant lors du repliement de Tox62ETag, les intermédiaires C et D de Tox62ETag froide ont été purifiés par HPLC phase inverse puis bloqués au MTSBS. Ces intermédiaires ont ensuite été analysés en isoélectrophorèse (Figure 54).

Les formes réduite, C, D et native de Tox62 ETag ont un pI de respectivement 4 ; 6,9; 6,9 et 9,3 (Figure 54). Pour pouvoir comparer les positions des intermédiaires dans différentes expériences, une mesure de la position d’une forme intermédiaire relativement aux formes réduites et oxydées a été définie. Cette mesure, appelée Rf est égale à la distance entre un intermédiaire et la forme oxydée divisée par la distance entre la forme réduite et la forme oxydée. Les valeurs de Rf pour C et D sont respectivement de 0,54 et 0,53.

Le résultat de l’analyse du repliement de Tox62ETag 35_{S à 20nM par isoélectrophorèse est}

présenté en Figure 55. La bande majoritaire au temps 1 heure a un Rf de 0,51 comparable aux valeurs de l’intermédiaire C et de l’intermédiaire D de Tox62ETag (respectivement 0,53 et 0,54). Il semble donc que cette bande soit composée des intermédiaires C et D de Tox62ETag. Ces intermédiaires ont des pI très semblables c’est pourquoi lorsqu’ils sont tous deux présents, il est difficile de les différencier. Les évolutions de la forme réduite, de cette bande et de la forme oxydée sont comparables à celles obtenues en HPLC (Figure 54).

Ces résultats montrent que pour Tox62ETag le mécanisme et la cinétique de repliement sont conservés que la concentration en protéine soit de 20nM ou de 15µM.

Cette méthode permet donc de suivre l’évolution des formes intermédiaires pour des concentrations en toxine réduite de l’ordre du nanomolaire.

Résultats

134

Figure 54 : Gel d’isoélectrophorèse coloré au bleu de Coomassie des intermédiaires C et D de Tox62 Etag purifiés en HPLC et bloqués au MTSBS

Figure 55 : Repliement de Tox62Etag suivi en isoélectrophorèse à 20 nM

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