Clonage amplification et vérification du gène 1 Le vecteur utilisé

Figure 20 : Schéma du vecteur pCP.

pCP AmpR ORI ZZ Tox Promoteur P10ØT7 BamH1 KpnI

Matériels et méthodes

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Ce vecteur permet l’insertion d’un gène entre les sites de restriction KpnI et BamHI. La séquence correspondant à la toxine est ainsi fusionnée à celle de la protéine ZZ permettant la production d'une toxine hybride ZZ-Tx sous la dépendance d'un promoteur transcrit uniquement par l'ARN polymérase du phage T7(P10ØT7) . Il convient de noter qu'un résidu méthionine

occupe la position -1 par rapport au résidu N-terminal de la toxine.

1.3.2 Préparation du vecteur

Le vecteur pCP est digéré successivement par deux enzymes de restriction BamHI et KpnI. Il est ensuite déphosphorylé par l’utilisation de l’enzyme CIP(Calf Intestine Phosphatase).

1.3.3 Préparation de l’insertion

L’insertion est digérée successivement par les deux enzymes de restriction BamH1 et KpnI.

1.3.4 Réaction de ligation

La réaction de ligation est effectuée par la mise en présence du vecteur (50 ng), de l’insert (en excès molaire 5 ou 10x soit 12 ou 24 ng), de la ligase et de son tampon. La réaction se fait dans un volume de 50µL à température ambiante pendant 10 minutes.

1.3.5 Transformation des bactéries

Immédiatement après la ligation, des bactéries E. Coli XL1 Blue sont transformées. 2 µL de réaction de ligation sont dilués dans 50 µL de bactéries compétentes. Les bactéries sont incubées 30 minutes dans la glace, subissent un choc thermique à 42°C, puis sont remises à incuber 2 minutes dans la glace. La culture est diluée dans 950 µL de milieu SOC puis incubée 1 heure à 37°C. 100µL de culture sont ensuite étalés sur une boîte de LB contenant de l’ampicilline à 200mg/mL. Les boîtes sont incubées une nuit à 37°C.

1.3.6 Vérification des clones

Les clones obtenus sont utilisés pour réaliser une PCR sur colonie permettant d’amplifier le gène qui a été intégré. On prépare dans ce cas un mélange de PCR identique à celui préparé pour la mutagenèse à ceci près que l’enzyme utilisée est une thermopolymérase (Biolabs) et le mélange réactionnel ne contient pas de matrice. Une fois le mélange préparé, les bactéries sont prélevées puis inoculées dans ce mélange. La matrice est contenue dans ces bactéries dans le cas où elles ont intégré le plasmide et le gène. Le programme utilisé est le même que pour la mutagenèse avec une étape supplémentaire (5min à 95°C) destinée à casser les cellules et à libérer leur contenu en acides nucléiques.

Après vérification par électrophorèse sur gel d’agarose 2% de la taille des fragments d’ADN amplifiés, il est possible de déterminer les clones ayant intégré un vecteur contenant le gène de la toxine.

1.3.7 Miniprep sur la colonie vérifiée

Les clones sélectionnés sont mis en culture dans 10mL de milieu LB liquide pour la nuit. L’utilisation d’un kit d’extraction (miniprep Wizard plus Promega) permet d’extraire l’ADN de ces cultures. Le plasmide purifié est précipité à l’éthanol, séché, et repris dans de l’eau PPI (Pour Préparation Injectables) puis stocké à –20°C.

1.3.8 Vérification de la séquence

La séquence du gène intégré dans ces clones est vérifiée par l’utilisation de la méthode des « Big Dye Terminator » (Applied Biosystem). Les plasmides correspondant aux clones vérifiés sont conservés à –20°C.

Matériels et méthodes

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1.4 Expression et purification

1.4.1 Stratégie de production et de purification

Drevet et al. ((Drevet et al., 1997)) avaient démontré la possibilité de produire une neurotoxine de serpent (Erabutoxine a) chez E. coli en utilisant le système d’expression DE3 LysS associé au vecteur pCP. Nous avons utilisé ce système d’expression dans cette étude. La Figure 21 présente les différents éléments contenus dans le cytoplasme d'une bactérie BL21(DE3) Lys S.

Figure 21 : Système d’expression DE3 LysS associé au vecteur pCP.

Les bactéries DE3 ont été conçues pour exprimer un gène cloné, sélectivement et avec un haut niveau d’expression. Le gène de l’ARN polymérase du phage T7 a été incorporé dans le chromosome de ces bactéries sous contrôle de LacI ((Studier and Moffatt, 1986)). Cette polymérase a la particularité d’être hautement sélective des promoteurs du phage T7. Notre gène est placé sous contrôle du promoteur de la protéine 10 du phage T7(P10ØT7). Pour diminuer la

fuite d’expression liée à ce système, un deuxième plasmide contenant le lysozyme du phage T7 a été ajouté ((Studier, 1991)). Ce lysozyme a la propriété d’inhiber l’action de l’ARN polymérase du phage T7 (DE3 LysS). L’ajout d’IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) dans le milieu de culture induit l’activation du gène de l’ARN polymérase du phage T7. Le promoteur P10ØT7

contenu dans le vecteur pCP permet l’initiation de la transcription du gène de la toxine par l’ARNpolymérase du phage T7.

Le plasmide pCP contient la fusion de la toxine à la protéine ZZ. Cette protéine est composée de deux domaines synthétiques Z, dérivés du domaine B de la protéine A du staphylocoque ( (Nilsson et al., 1987)). Les avantages de ce système sont que d’une part la protéine ZZ est très bien exprimée chez E.coli. Une fois libérée dans le cytoplasme bactérien, la fusion est moins sujette à la dégradation et est plus soluble que la toxine seule. D’autre part la protéine ZZ ayant la propriété de se lier aux IgG (Immunoglobulines de classe G), elle fournit une méthode simple et efficace de purification de la fusion par chromatographie d’affinité sur colonne d’IgG-Sepharose. Enfin comme il n’existe qu’une méthionine en –1 de la toxine, il est possible de séparer la toxine de la protéine de fusion par coupure au bromure de cyanogène.

pCP AmpR ORI ZZ Tox Prom. P10ØT7 Chromosome bactérien Lac I ARNpol ØT7 ChloramphénicolR Lysozyme S + IPTG 1 2

Matériels et méthodes

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1.4.2 Protocole de production et de purification

Les bactéries DE3 Lys S sont transformées avec le plasmide pCP contenant le gène de la protéine que l’on souhaite produire. A 50 µL de bactéries compétentes on ajoute 20 ng de vecteur. Le mélange est incubé 30 minutes dans la glace puis subit un choc thermique de 1 minute à 42°C et est remis à incuber dans la glace. Le mélange est ensuite dilué 20 fois dans du milieu SOC puis incubé une heure à 37°C. 100µL de culture sont prélevés puis étalés sur une boîte LB Agar contenant de l’ampicilline (200µg/mL) et du chloramphénicol (30µg/mL). Les boîtes sont incubées une nuit à 37°C. Lors de la pré-culture, une colonie isolée est mise en culture dans 10 mL de milieu LB contenant de l’ampicilline (200µg/mL) et du chloramphénicol (30µg/mL). Le tube est incubé une nuit à 37°C. La culture d’expression est effectuée à partir de 2 mL de pré-culture dilués dans 200mL de milieu LB contenant de l’ampicilline (200µg/mL) et du chloramphénicol (30µg/mL). Elle est effectuée à 37°C pendant environ 2h30. Lorsque la tubidité mesurée à 600nm atteint environ 0,8 , l’IPTG est ajouté afin d’atteindre une concentration finale de 1mM. Le mélange est incubé pendant 4 heures à 37°C. Les cultures sont centrifugées pendant 30 minutes à 10 000 tr/min à 4°C. Le culot est repris dans du tampon PBS 1X avec EDTA 1mM et DTT 10mM. Les suspensions cellulaires sont congelées pour la nuit.

1.4.2.2 Extraction

Une fois les suspensions décongelées, ces-dernières sont recongelées dans un mélange d’éthanol et de carboglace pendant 20 minutes puis passées à la presse Eaton. Le mélange est soumis aux ultrasons pour casser les acides nucléiques. Du PMSF et du sulfate de protamine sont ajoutés aux cellules cassées pour atteindre une concentration de respectivement 0,5mM et 2 mg/L. Le mélange est incubé 10 à 15 minutes dans la glace puis centrifugé 10 minutes à 4°C à 10 000 tr/min. Le surnageant est récolté.

1.4.2.3 Chromatographie d’affinité et repliement

L’extrait protéique est incubé sous agitation en présence d’IgG-sepharose dans du PBS contenant de l’EDTA à 1mM pendant 30 minutes à 4°C. Le mélange est coulé dans une colonne de verre (Biorad). La matrice est ensuite lavée avec du tampon PBS +EDTA 1mM jusqu’à élimination de la fraction non retenue. La colonne est ensuite rincée avec 2 volumes de tampon de repliement (Tris-HCl 100mM pH 7,6, EDTA 1mM, GSH/GSSG : 3/0,3mM) puis incubée 48 heures à 20°C. La colonne est ensuite lavée en PBS, puis les protéines retenues sont éluées en acide acétique pH 3,4. La fraction éluée contenant la fusion que l’on appellera ZZtox est purifiée sur HPLC phase inverse sur colonne C5 (Supelco, 250x10mm). Le tampon A est une solution d’acide trifluoroacétique (TFA) 0,1%vol dans l’eau. Le tampon B contient de l’acétonitrile à 90%vol dans l’eau et du TFA à 0,1%vol. Le gradient permet de passer de 18 à 35 % d’acétonitrile en 30 minutes à un débit de 3 mL/min. Le pic correspondant à la fusion est récolté puis lyophilisé.

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1.4.2.4 Coupure au bromure de cyanogène et purification de la toxine

La séparation de la protéine de fusion ZZ de la toxine est effectuée par coupure au bromure de cyanogène (CNBr). Le mélange réactionnel contient : 100 excès molaires de CNBr, 100mM de tryptophane et de l’acide chlorhydrique à 0,1 N. La présence de tryptophane dans le milieu permet d’éviter une dégradation excessive des tryptophanes des toxines sous l’action de l’acide. Le mélange est ensuite incubé 6 heures à température ambiante et à l’abri de la lumière puis dessalé sur une colonne de gel filtration PD10 (GE Healthcare) La purification de l’échantillon est effectuée en HPLC phase inverse sur colonne C5 (Supelco, 250x10mm). On utilise alors un protocole identique à celui de la purification de ZZtox. La fraction susceptible de contenir la toxine est récoltée puis lyophilisée. Un échantillon de la protéine isolée est ensuite analysé par spectrométrie de masse afin de vérifier que la protéine produite a une masse identique à celle attendue.

1.4.2.5 Rendements de production et de purification

Pour la production de la protéine Tox62, à partir d’un litre de culture, on obtient 83 mg de fusion ZZ/toxine, ce qui correspond à 28 mg de toxine. Après coupure et purification en HPLC, 8,5 mg de Tox62 pure sont récupérés.

Les rendements de production obtenus pour les autres mutants sont comparables à ceux de Tox62. Pour les mutants de ponts, des étapes supplémentaires de purification ont été nécessaires, les rendements de purification de ces mutants étaient donc fortement inférieurs (3 mg de toxine pure pour 1L)

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2 MARQUAGE DES TOXINES

2.1 Marquage à la biotine

Une solution contenant le mutant polySC (voir Tableau 4) à une concentration 1,5 µM dans un tampon 50 mM Tris-HCl pH 7,8 est préparée. De la biotine-BMCC (Pierce) est ajoutée pour atteindre une concentration de 0,4 mM. Après deux heures d’incubation à température ambiante, Tx62polySC-biot est purifié par HPLC phase inverse sur colonne C5(Supelco, 250x10mm) en utilisant le gradient utilisé pour purifier ZZTox (voir ci-dessus). La molécule obtenue est appelée polySC-biot. Le même protocole est utilisé pour produire polySETAGC-biot à partir de polySETAGC.