Chapitre 3. Induction de la myogenèse à l’aide de facteurs de transcription
3.2 Matériels et méthodes
3.2.2 Production des protéines recombinantes
3.2.2.1. Transformation des bactéries thermo-compétentes
100 ng de chacun de plasmides recombinants ont été ajoutés à 100 µl de bactéries compétentes E. coli BL21 (DE3), une souche possédant un gène de résistance à l'antibiotique chloramphénicol. Le mélange bactérien a été mis sur glace pendant 30 minutes avant l'induction d'un choc thermique à 42°C pendant 90 secondes. Le mélange a ensuite été remis sur glace pour deux minutes. 300 µl de LB stérile ont été ajoutés avant une incubation d'une heure à 37°C, sous agitation à 280 rpm.
3.2.2.2. Culture des bactéries transformées
200 µl de chaque mélange ont été étalés sur la surface de pétris LB agar contenant de l'ampicilline (50 µg/ml) et du chloramphénicol (34 µg/ml) pour la sélection des bactéries qui ont intégré les vecteurs. Les pétris ont ensuite été incubés pour la nuit à 37°C. Le lendemain, une colonie par construction a été prélevée pour être cultivée dans 5 ml de LB, contenant toujours les mêmes concentrations d'antibiotiques, à 37°C toute la nuit, sous agitation. Le matin du troisième jour, 2 ml de la culture bactérienne obtenue ont été mis dans 200 ml de LB, contenant les mêmes antibiotiques de sélection, avant d'être incubés à 37°C sous agitation. Cette incubation a duré jusqu'à l'obtention d'une densité optique entre 0,7 et 0,8, à une longueur d'onde de 600 nanomètres, afin d'avoir des bactéries dans la phase de croissance exponentielle.
3.2.2.3. Induction de la production des protéines recombinantes
Les productions de chacune des protéines recombinantes 6xHis-Tat-MyoD, 6xHis-Tat-Pax3, 6xHis-Tat-Pax7, ont été induites suite à l'ajout d'IPTG, à une concentration finale de 1 mM [116]. Les protéines ont été induites pendant quatre heures, toujours sous agitation, à des températures spécifiques (Tableau 3).
Tableau 3. Températures de production des protéines recombinantes dans les bactéries E. coli BL21 (DE3).
Protéines 6xHis-Tat-MyoD 6xHis-Tat-Pax3 6xHis-Tat-Pax7
Températures 30°C 37°C 37°C
3.2.2.4. Détection des protéines par immunobuvardage de type Western
30 µg de chaque protéine ont été mis sur gel SDS-PAGE (gel de concentration 4 % et gel de séparation 10 %). Une migration à 70 V pour 15 minutes, puis 100 V pour 90 minutes supplémentaires a été effectuée dans un tampon de migration (Tris 50 mM, 0.2 M Glycine et 0,1 % SDS). Les protéines ont été transférées sur une membrane de nitrocellulose (Bio-Rad), à 200 mA à 4°C pour une heure, à l’aide d’un tampon de transfert (Tris 50 mM, 0.2 M Glycine, 0,1 % SDS et 20 % méthanol). Les membranes ont été incubées dans une solution de blocage (0,1 % PBS, 0,05 % Tween20® et 5 % de lait écrémé en poudre) pendant une heure à température pièce. Ensuite, les
membranes ont été incubées pour la nuit à 4◦C, sous agitation, avec une solution d’anticorps de
souris contre la queue poly-histidine des protéines (Anti-6X His tag®, Abcam, USA, dilué 1 : 1 000 dans la solution de blocage). Le lendemain, les membranes ont été lavées trois fois avec la solution de lavage, c’est-à-dire une solution 0,1 % PBS et 0,05 % Tween20®, pour 10 minutes. Une
immunoglobuline de lapin anti-souris (Dako) couplée à l’HRP, diluée à 1 : 1 000 dans la solution de blocage, a été incubée sur les membranes pendant une heure à température pièce. Une autre série de trois lavages a été nécessaire avant de mettre la membrane pendant quatre minutes dans une solution pour induire la chimiluminescence (Clarity Western ECL substrate). Les résultats ont été visualisés en exposant un film autoradiographique HyBlot® CL (Denville Scientific) aux membranes
pendant 5 secondes.
3.2.2.5. Lyse des cellules bactériennes
Les culots bactériens ont été remis en suspension dans un tampon de lyse, ou NPI-0 (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl et 8 M urée (pH 8.0)). Ces solutions ont subi une sonication à 4°C.
Les lysats ont été centrifugés à 4◦C, à 9 500 rpm pendant 20 minutes. Le surnageant obtenu
contenait la fraction soluble alors que le culot contenait celle insoluble (débris cellulaires et protéines insolubles). Les surnageants ont donc été filtrés à l'aide d'un filtre de 0,45 µm.
3.2.2.6. Purification des protéines recombinantes
La purification s'est effectuée par chromatographie d'affinité métallique. Ce système est basé sur l'affinité spécifique entre la queue poly-histidine des protéines recombinantes (soit en N- ou en C-
terminal) et, dans notre cas, les ions Ni2+ de la matrice de la colonne (6xHis-Tat-Pax3) ou de la
résine (6xHis-Tat-MyoD et 6xHis-Tat-Pax7) [117].
Tout d'abord, pour 6xHis-Tat-MyoD et 6xHis-Tat-Pax7, 1 ml de gel d'affinité contenant des billes d'agarose chargées avec des ions de nickel, le HIS-Select HF Nickel Affinitiy (Sigma) a été équilibré avec 10 ml de NPI-0. 10 ml des différents filtrats ont été ajoutés aux gels sous agitation pour 30 minutes, puis centrifugés à 5 000 g pendant cinq minutes. Deux lavages de quatre minutes, suivis d'une centrifugation, ont été effectués à l'aide d'un tampon de lavage, ou NPI-10 (50 mM NaH2PO4,
300 mM NaCl, 10 mM Imidazole et 8 M urée (pH 8.0). 10 ml de tampon d’élution (50 mM NaH2PO4,
300 mM NaCl, 300 mM Imidazole et 8 M urée (pH 8.0)) ont été mélangés aux solutions pendant 30 minutes avant d'être centrifugés, dans le but d’éluer les protéines.
Pour 6xHis-Tat-Pax3, la purification s’est effectuée sur colonne de nickel à l’aide de la Ni-NTA
superflow column (Qiagen), selon le protocole du fabricant, en condition dénaturante avec les
mêmes tampons utilisés que pour la purification sur résine HIS-Select HF Nickel Affinity.
Des échantillons de chaque fraction ont été prélevés et analysés sur gel SDS-PAGE coloré au
Coomassie Blue R-250.
3.2.2.7. Dessalage et renaturation des protéines recombinantes
Les protéines ainsi obtenues ont par la suite été dessalées à l'aide des colonnes Zeba™ Spin
desalting Columns (Thermo Scientific), selon le protocole du fabricant. Brièvement, les colonnes sont
équilibrées à l'aide de 2 ml de tampon NPI-0, supplémenté de 100 mM de L-arginine, pour permettre la renaturation, ainsi que de 20 % de glycérol, pour conférer une certaine stabilité aux protéines. Pour ce faire, une série de trois lavages, avec ce NPI-0 supplémenté, et des centrifugations à 2 400 rpm pour cinq minutes, sont nécessaires. Les protéines sont alors mises dans les colonnes et centrifugées à une vitesse de 2 400 rpm pour dix minutes pour en recueillir l'éluat. Les protéines obtenues ont été dosées par la méthode BCA (Thermo Scientific), selon le protocole du fabricant,