Construction des vecteurs d’expression

Les vecteurs d'expression pET-16b-6x[His]-Tat-MyoD, pET-16b-6x[His]-Tat-Pax3 et pET-16b-6x[His]- Tat-Pax7 ont tous les trois été construits par la même méthode de clonage à partir du plasmide d'expression pET-16b (Novagen, Allemagne) (Figure 18). Ce plasmide comporte trois sites de clonage multiple permettant d'introduire les séquences d'intérêt. De plus, il code pour une queue poly-histidine qui se retrouvera en N-terminal des protéines recombinantes et qui permettra leur purification par chromatographie d'affinité métallique. Un gène de résistance à l'ampicilline est aussi présent, pour permettre la sélection des cellules bactériennes ayant incorporé le plasmide.

Figure 18. Représentation schématique du plasmide pET-16b.

Le plasmide pET-16b possède trois sites de clonage multiples, la séquence d'une queue poly- histidine, et un gène de résistance à l'ampicilline. Image tirée de Biovisualtech, 2013 [111].

L'expression du gène d'intérêt est sous le contrôle du promoteur T7, dont l'activation est obtenue par l'ajout d'isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG), qui permet la production de la T7 ARN polymérase (Figure 19).

Figure 19. Mécanisme de l'induction à l'IPTG. Image adaptée de pET system manual [112].

Des réactions en chaîne par polymérase (PCR; C1000 Touch™_{, Bio-Rad) ont été réalisés afin}

d’amplifier le plasmide pET-16b et les gènes Pax3, Pax7 et MyoD à l’aide d’amorces sens et antisens spécifiques (Tableau 1). Les amorces utilisées pour l’amplification de Pax3, Pax7 et MyoD contenaient une partie homologue à un site de clonage multiple du vecteur pET-16b, la partie codante pour le peptide Tat, ainsi qu'une partie homologue au gène d'intérêt. Ces amorces ont permis l'ajout de nucléotides aux fragments amplifiés. 10 % de diméthylsulfoxyde ont dû être ajoutés pour l'amplification de MyoD afin de permettre un bon appariement des amorces.

Les gènes MyoD et Pax3 ont été amplifiés à partir de plasmides gracieusement fournis par le Dr. Rénald Gilbert, alors que le plasmide de Pax7 a été acheté chez Open Biosystem (ThermoScientific).

Tableau 1. Séquences des amorces utilisées.

Gè

nes Orientation Séquences des amorces 5’-3’

M

yoD

Sens

Tat Espacement Start Gène d’intérêt

TACGGACGAAAAAAACGACGACAACGACGACGA GGATCCGGA ATG GAGCTACTGTCGCCACC Anti-sens pET-16b Stop Gène d’intérêt

TTAGCAGCCGGATCC TCA GAGCACCTGGTATATCGGGTT

Pax3

Sens

Tat Espacement Start Gène d’intérêt

TACGGACGAAAAAAACGACGACAACGACGACGA GGATCCGGA ATG ACCACGCTGGCCGG Anti-sens pET-16b Stop Gène d’intérêt

TTAGCAGCCGGATCC TCA GAACGTCCAAGGCTTACTTTGTCC

Pax7

Sens

Tat Espacement Start Gène d’intérêt

TACGGACGAAAAAAACGACGACAACGACGACGA GGATCCGGA ATG GCGGCCCTTCCCGG Anti-sens pET-16b Stop Gène d’intérêt

TTAGCAGCCGGATCC TTA GGTGAACTGTTCCATCTGGCT

pE

T-

16b Sens GGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGA

Anti-sens TTTTTTTCGTCCGTAATGGCCGCTGCTGTGATGATGATG

Les paramètres d'amplification utilisés avec le thermocycleur pour permettre l'amplification de l'ADN sont décrits dans le Tableau 2. D'abord, les échantillons ont subi une étape de dénaturation à 98°C pendant trois minutes. Par la suite, des cycles de dénaturation, appariement et synthèse ont permis l'amplification exponentielle de l'ADN. Les températures de ces cycles dépendaient de la séquence des amorces. Un dernier cycle de polymérisation de trois minutes à 72°C permettait la synthèse finale des brins d'ADN.

Tableau 2. Paramètres pour l'amplification par PCR des gènes MyoD, Pax3 et Pax7.

MyoD Pax3 Pax7

98°C x 3 m 98°C x 10 s 55°C x 20 s 5 72°C x 45 s cycles 98°C x 10 s 65°C x 20 s 34 72°C x 1 m cycles 98°C x 10 s 52°C x 20 s 34 72°C x 1 m cycles 98°C x 10 s 60°C x 20 s 30 72°C x 45 s cycles 72°C x 3 m

Pour s'assurer de l'identité des fragments obtenus, 2 µl de chaque réaction PCR ont été mis sur gel d'agarose 1 % pour une migration à 100 V pour 45 minutes. Le visionnement des bandes présentes sur le gel a été effectué à l'aide de l'AlphaImager.

Les fragments d'ADN amplifiés ont par la suite été purifiés par la méthode phénol-chloroforme [113], puis précipités au chlorure de sodium (NaCl) [114]. Brièvement, un volume de phénol/chloroforme a été ajouté à l'ADN, agité avec un vortex et centrifugé deux minutes à 13 200 rpm. La phase aqueuse a ensuite été récupérée et mise dans un autre tube. Du NaCl 5 M, l'équivalent de 1/10 du volume de mélange précédant, a été ajouté avant d’agiter avec un vortex à nouveau. Deux volumes d'éthanol 100 % ont été ajoutés. Les mélanges ont par la suite subi une congélation rapide dans l'azote liquide pendant une minute, afin de faire précipiter l'ADN. Les ADN ont subi une autre centrifugation pour sept minutes. Le surnageant a été retiré et un lavage à l'éthanol 70 % a été effectué. Le culot obtenu a été remis en suspension dans de l'eau stérile sans DNase/RNase.

La totalité de l'ADN purifié a ensuite été mise sur gel d'agarose 1 % pour une autre migration de 45 minutes à 100 V. Les bandes obtenues correspondantes aux gènes amplifiés ont été retirées manuellement du gel et l'ADN a été extrait avec le QIAquick Gel extraction Kit, (Qiagen, Allemagne),

un chevauchement de 15 pb à leurs extrémités. Ce chevauchement est créé lors de la synthèse des amorces pour l’amplification des gènes à insérer. Techniquement, 1 µl du vecteur pET-16b a été incubé avec 2 µl de chacun des inserts en présence de 1 µl d’eau stérile sans DNase/RNase et de 1 µl de réactif In-Fusion, pendant 20 minutes à 50°C.

100 ng de chacun des plasmides recombinants ont été mélangés dans 100 µl de bactéries E. coli DH5 thermo-compétentes pour effectuer une transformation bactérienne. Les mélanges ont été maintenus sur glace pendant 20 minutes avant de subir un choc thermique dans un bain-marie à 42°C pendant 90 secondes pour favoriser l'entrée de chacun des plasmides dans les bactéries. Les mélanges ont ensuite été remis sur glace pour deux minutes, puis 300 µl de milieu Luria-Bertani (LB) stérile y ont été ajoutés. Les mélanges ont été incubés pendant une heure à 37°C, sous agitation, à une vitesse de 280 rpm. 200 µl de chaque mélange ont par la suite été étalés sur des pétris de LB, d'agar solide (15 g/l) et d'ampicilline (50 µg/ml). L'antibiotique a servi pour sélectionner les colonies ayant incorporé les plasmides qui y sont résistants. Ces pétris ont été incubés toute une nuit à 37°C. Le lendemain, cinq clones ont été sélectionnés pour chacune des constructions et cultivés dans 5 ml de LB avec de l’ampicilline (50 µg/ml), à 37°_{C et à 280 rpm, pour toute la nuit. Puis, l’ADN}

plasmidique a été extrait à l’aide du QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen), selon le protocole du fabricant. Le succès des clonages a été vérifié par séquençage des plasmides.