Chapitre 1 : Introduction
2.4 Discussion
La thérapie cellulaire présente une avenue thérapeutique intéressante pour la DMD. Il a d’ailleurs été démontré dans plusieurs études que la greffe de myoblastes sains rétablit l’expression de dystrophine dans les muscles de patients atteints de DMD [55, 56, 104]. Les hiPSCs dérivées de fibroblastes du patient lui-même représentent une source renouvelable de cellules myogéniques, tout en réduisant le risque de réactions immunitaires. Toutefois, pour un traitement éventuel de la DMD, il est nécessaire que ces cellules soient corrigées génétiquement afin de contenir le gène de la dystrophine.
Étant donné la très grande taille de la dystrophine (ADNc d’environ 11 kb), une version tronquée du gène, c’est-à-dire la micro-dystrophine, a été choisie pour mon projet de recherche. Un court peptide (V5) y a été fusionné pour faciliter la détection de la protéine d’intérêt. L’ADNc de la µDysV5 était sous le contrôle du promoteur MCK, donc son expression n’était possible que lorsque les cellules avaient fusionné avec les fibres musculaires de l’hôte. Ce transgène a été transféré dans des MSCs dystrophiques obtenues à partir d’hiPSCs de patient DMD, et ce, à l’aide d’un vecteur lentiviral de troisième génération. Ce vecteur a été choisi pour sa capacité à transduire des cellules en division ou non. De plus, sa capacité d’intégration dans le génome de l’hôte permet une longue expression du transgène tout en ayant de plus faibles risques de mutagenèse d’insertion [48]. La différenciation de ces MSCs corrigées en myoblastes a ensuite été effectuée à l’aide d’un vecteur adénoviral codant pour MyoD. Cette méthode de livraison a été sélectionnée puisqu’elle ne provoque pas l’intégration du transgène et son expression n’est que transitoire. Cette relativement courte expression de MyoD permet d’induire l’expression du MyoD endogène, puisqu’il s’agit d’un gène qui s’autorégule. Ainsi, une fois les cellules transduites, la cascade de signalisation myogénique est enclenchée, résultant en la différenciation des MSCs en myoblastes.
L’efficacité de la technique de greffe des myoblastes dérivés d’hiPSCs DMD, corrigés génétiquement, a été démontrée par la présence de fibres hybrides exprimant la bêta-spectrine
du complexe de glycoprotéines associé à la dystrophine. Les MSCs n’ayant pas été transduites avec l’Ad.CAG-MyoD n’ont pas fusionné avec les fibres de l’hôte. Ceci indique qu’un stade de différenciation plus tardif doit être atteint afin d’y parvenir. Sachant que des stades de différenciation trop avancés diminuent le potentiel de fusion des cellules, une étude de la transduction avec l’Ad.CAG-MyoD selon le temps et l’expression des gènes nous permettrait d’obtenir un meilleur succès de greffe. De plus, il pourrait être avantageux d’utiliser un vecteur bidirectionnel dont l’expression de MyoD serait inductible et celle d’un gène rapporteur serait constitutive. De cette façon, les cellules transduites pourraient être sélectionnées, puis l’expression de MyoD pourrait être induite. La totalité des cellules ainsi obtenues aurait un potentiel de fusion optimal. Les essais in
vitro faits sur les myoblastes corrigés obtenus par différenciation d'hiPSCs DMD démontrent un faible
potentiel de fusion, ce qui laisse croire que le protocole de différenciation utilisé n'est pas idéal. Lors d'études futures, ce protocole devra être amélioré afin d'augmenter le succès de greffe. De plus, la version actuelle de la micro-dystrophine devra être remplacée par une autre contenant les exons nécessaires pour l'échafaudage de nNos au sarcolemme. Dans le but éventuel d'utiliser cette thérapie en clinique, il sera nécessaire de retirer les séquences codant pour des gènes de résistance ou rapporteurs, puisqu'ils pourraient potentiellement induire une réaction immunitaire chez le patient. Filareto et al. ont récemment utilisé une approche semblable à la nôtre. En effet, à l'aide d'un système de transposon contenant la micro-utrophine, ils ont réussi à corriger génétiquement des iPSCs dérivées de fibroblastes de souris mdx et dont le gène codant pour l’utrophine avait été désactivé. Les cellules ainsi corrigées ont été différenciées en cellules myogéniques à l’aide d’un facteur de transcription inductible, Pax3, puis greffées dans des muscles de souris. Le groupe a pu démontrer que les fibres hybrides résultantes exprimaient la micro-utrophine, que le complexe de glycoprotéines associé à la dystrophine était rétabli au sarcolemme et que la force contractile des muscles était augmentée. L’utrophine présente un attrait majeur en clinique, puisqu’elle est déjà exprimée chez l’humain. Sa surexpression ne causerait pas la réaction immunitaire parfois observée chez les patients DMD qui développent des anticorps contre la dystrophine suite au rétablissement de son expression par une thérapie [105]. De plus amples études doivent être faites afin d’évaluer l’impact de l’utrophine sur le système immunitaire et si elle peut, à tout le moins, réduire la sévérité du phénotype DMD chez l'humain.
Kimura et al. ont utilisé un vecteur lentiviral codant pour la micro-dystrophine administré de façon systémique à des souris mdx néonatales. Ce groupe a ainsi pu montrer que le transgène avait transduit les cellules satellites des souriceaux, amenant une expression stable du transgène durant deux ans. De plus, les capacités musculaires des souris traitées ont été améliorées. Toutefois, l’efficacité des dystrophines tronquées reste à être démontrée chez l’humain [106].
Le protocole développé précédemment par notre laboratoire pour différencier des hiPSCs en cellules myogéniques ne permet pas aux cellules myogéniques qui en résultent d’obtenir une capacité de fusion semblable à celles des myoblastes venant d’une culture primaire [20]. Plusieurs études ont été faites par d'autres groupes, proposant des méthodes pour différencier les iPSCs en myoblastes [95, 96]. Toutefois, peu de méthodes se sont montrées efficaces et reproductibles, ne produisant pas une population aux capacités semblables à celles des myoblastes. De plus, l'utilisation de vecteurs viraux est à éviter dans un contexte clinique. Ainsi, l'induction de la myogenèse pourrait être effectuée à l'aide de petites molécules, d’ARNm, ou de facteurs de transcriptions sous forme de protéines.