Cellules souches pluripotentes induites

Les caractéristiques des hESCs font en sorte qu'elles pourraient représenter un atout pour la médecine régénérative. Toutefois, leur provenance soulève des problèmes éthiques. De plus, il s'agit de cellules allogéniques, et leur utilisation clinique requerrait une immunosuppression du receveur. En 2006, Yamanaka et al. ont découvert les quatre facteurs de transcription nécessaires à la production de cellules souches pluripotentes induites (iPSCs) murines, c’est-à-dire Oct4, Klf4, Sox2 et c-Myc. Les cellules transduites à l'aide de rétrovirus codant pour ces quatre facteurs possèdent les caractéristiques des ESCs, c'est-à-dire la capacité d'auto-renouvellement et de différenciation dans les trois feuillets embryonnaires [86, 87]. En 2007, deux équipes de chercheurs ont réussi à dériver des iPSCs à partir de cellules somatiques humaines. Tout d'abord, le Dr. Yamanaka et son équipe ont poursuivi leur lancée en utilisant cette fois des lentivirus codant pour les quatre facteurs humains afin de transformer des fibroblastes en cellules souches humaines induites à la pluripotence (hiPSCs) [88]. L'autre équipe, celle du Dr. Thomson, a utilisé quatre lentivirus codant pour Oct4, Sox2, Nanog et Lin28. Malgré que les facteurs utilisés soient différents, les résultats obtenus étaient très similaires et permettaient l'obtention de cellules semblables aux hESCs [89]. Depuis, les recherches se poursuivent afin d'éliminer l'oncogène c-Myc ainsi que l'oncogène et suppresseur de tumeur Klf4, et éliminer l'utilisation de vecteurs viraux intégratifs, voir même remplacer ce type de vecteur totalement, par des plasmides, des protéines ou d'autres systèmes. Toutefois, l'élimination de c-Myc réduit l'efficacité de reprogrammation, déjà faible avec les quatre facteurs originaux. De plus, il faut déjà compter deux mois pour parvenir à une reprogrammation complète [89]. Des équipes travaillent donc à augmenter l'efficacité de reprogrammation à l'aide d'autres facteurs ou de petites molécules chimiques permettant de modifier la structure de la chromatine ou de moduler certaines voies de signalisation [90, 91]. Certaines recherches se concentrent sur des micro-ARN pour remplacer les facteurs ou améliorer l'efficacité de programmation [92]. La technique la plus courante de nos jours comprend l'utilisation du virus à ARN Sendaï, non intégratif, et efficace [93]. Plusieurs lignées d’hiPSCs ont été produites afin de modéliser diverses maladies pour en permettre l’étude. De plus, les hiPSCs représentent une avenue thérapeutique particulièrement intéressante puisqu’il est possible de créer des lignées de cellules spécifiques au patient, réduisant ainsi les risques de réactions immunitaires lors d’une greffe autologue. Il est donc nécessaire d’obtenir une

large quantité de cellules tissu-spécifiques, non tumorigéniques, capable de s’intégrer et de fonctionner chez l’hôte suite à une transplantation [94].

1.5.3. Myogenèse dirigée

Pour être utiles dans la médecine régénérative, les cellules souches doivent être différenciées spécifiquement au moment désiré. Les trois méthodes les plus couramment utilisées sont la formation de corps embryoïdes, l'utilisation d'un cocktail de facteurs de croissance spécifiques ainsi que la surexpression ou l’inhibition de gènes.

Plusieurs équipes ont tenté de mettre au point un protocole de différenciation myogénique efficace, permettant d'obtenir des myoblastes à partir d'hiPSCs, qui possèderaient les mêmes capacités de prolifération et de fusion que les myoblastes provenant d'une culture primaire [95, 96]. Toutefois, ces techniques, parfois complexes, ont connu des taux de succès variables in vitro, ou étaient peu reproductibles. Les cellules dérivées de ces protocoles ressemblent à des myoblastes, mais l'analyse de l'expression des gènes et l'observation de leurs capacités myogéniques révèlent qu'elles ne sont pas tout à fait de vrais myoblastes.

Darabi et al. ont démontré que l’expression inductible de Pax7 dans des iPSCs murines lors de la formation de corps embryoïdes résulte en des cellules pouvant être purifiées par l’expression du récepteur alpha du PDGF, un marqueur du mésoderme para-axial. La transplantation des cellules myogéniques précurseurs ainsi obtenues chez la souris dystrophique a résulté en un succès de greffe élevé et une augmentation de la contractilité des muscles [97].

Récemment, le groupe de Tanaka et al. a montré que l'expression inductible de MyoD dans des hiPSCs spécifiait les cellules dans la voie myogénique avec une efficacité de 70-90 %. L'analyse de l'expression des gènes des myoblastes résultants démontre une grande ressemblance avec des myoblastes humains venant d'une culture primaire. Toutefois, l'expression de Myf5 est manquante dans ces cellules, impliquant que le protocole utilisé emprunte une voie de différenciation différente

myogénique à l'aide de facteurs de croissance recombinants est en cours d'étude. Cette technique sera quant à elle décrite au chapitre 3.

Chapitre 2. La thérapie génique ex vivo à l’aide d’hiPSCs DMD

et d’un vecteur lentiviral codant pour la micro-dystrophine

2.1. Objectif

La thérapie cellulaire représente une avenue thérapeutique intéressante, mais plusieurs limitations demeurent. En effet, le grand nombre de cellules requises pour traiter tous les muscles d'un patient représente un obstacle de taille. Pour y pallier, des hiPSCs dérivées de cellules du patient lui-même pourraient être utilisées, car elles représentent une source renouvelable de cellules myogéniques. Ces cellules doivent cependant être corrigées génétiquement afin de leur permettre d'exprimer une dystrophine fonctionnelle dans les muscles du patient greffé. Une des difficultés réside dans la correction efficace, puisque la dystrophine est le plus long gène du corps humain. En principe, l’ADNc de la dystrophine pourrait être simplement transfecté dans les hiPSCs. Cependant, l’ADNc de la dystrophine étant de plus de 11 kb, l’efficacité de transfection et le taux d’intégration sont très bas. Sachant que la micro-dystrophine possède une fonctionnalité semblable à celle de la dystrophine pleine longueur, et que sa taille réduite (3.6 kb) permet l'entrée dans un vecteur, l'hypothèse de travail est la suivante: la correction ex vivo d'hiPSCs dystrophiques à l'aide d'un vecteur viral codant pour la micro-dystrophine permettra l'expression d’une dystrophine fonctionnelle dans les muscles qui recevront une greffe de ces cellules corrigées. Un vecteur lentiviral de troisième génération a été choisi afin de permettre une transduction des cellules en division ou non, ainsi qu’une longue expression du transgène due à une intégration dans le génome de l’hôte, tout en ayant un plus faible taux de mutagenèse d’insertion [48].

Les hiPSCs DMD sont différenciées en myoblastes suivant le protocole de différenciation établi par mon prédécesseur, impliquant un milieu myogénique développé dans notre laboratoire, ainsi qu’un vecteur adénoviral codant pour MyoD. Les myoblastes corrigés ainsi obtenus sont ensuite micro- injectés dans le Tibialis anterior (TA) de souris Rag/mdx, c’est-à-dire à la fois immunodéficientes et dystrophiques. L’expression de la micro-dystrophine est évaluée un mois plus tard.

2.2. Matériels et Méthodes

2.2.1. Production des vecteurs viraux

2.2.1.1. Vecteur lentiviral codant pour la micro-dystrophine (Le.MCK-µDysV5)

Un vecteur lentiviral (Le.MCK-µDysV5) codant pour la micro-dystrophine (µDys) de chien fusionnée à un tag V5 était sous contrôle du promoteur muscle creatine kinase (MCK). Le gène de la micro- dystrophine a été créé par l’équipe du Dr. Xiao Xiao [98]. Le tag V5 y a été ajouté pour faciliter la détection de la micro-dystrophine. Le promoteur MCK permet une activation spécifique de la transcription du transgène, puisqu’il n’est activé que lorsque les cellules sont en différenciation terminale, sous forme de fibres musculaires. Le vecteur contient aussi un gène de résistance à la puromycine pour permettre une sélection des cellules transduites (Figure 12). Le plasmide pLenti 6/V5 MCK.µDysV5 était déjà disponible au laboratoire.

Figure 12. Vecteur Le.MCK-µDysV5.

Le vecteur lentiviral codant pour la micro-dystrophine fusionnée à un tag V5, sous le contrôle du promoteur MCK possède un gène de résistance à la puromycine.

Des cellules de la lignée HEK 293T ont été cultivées jusqu’à 70 % confluence dans du High glucose

Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM; Sigma, Oakville, Ontario, Canada) supplémenté avec de

la L-glutamine, 10 % de sérum de veau foetal (FBS; Gibco, Burlington, Ontario) et 100 U/ml de pénicilline et streptomycine (P/S; Gibco). Puis, elles ont été transfectées avec des plasmides codant

2.2.1.2. Vecteur adénoviral codant pour MyoD (Ad.CAG-MyoD)

Un vecteur adénoviral de type 5 codant pour MyoD sous le contrôle du promoteur ubiquitaire

cytomegalovirus early enhancer/chicken β-actin (CAG) a été gracieusement fourni par le Dr. Isao

Fujii [101]. Les vecteurs viraux ont été produits à l’aide de la lignée HEK 293T. Les cellules ont été cultivées jusqu’à 70 % confluence dans du DMEM supplémenté avec 10 % FBS et 100 U/ml de P/S, puis ont été transduites avec l’Ad.CAG-MyoD dans une multiplicité d’infection (MI) de 3. Les cellules ont été maintenues en culture pour une période additionnelle de 48 heures. Elles ont par la suite été détachées mécaniquement et le milieu a été récupéré pour subir trois cycles de congélation/décongélation à l'aide d'azote liquide et d'un bain-marie à 37C. Le titre viral a été estimé par la technique de dilutions successives.