Pr´ eparation des lames microscopiques

Dans cette partie, nous d´ecrivons la pr´eparation des lames microscopiques ou des sp´ e-cimens que nous allons ´etudier. Nous pr´esentons d’abord la pr´eparation d’une lame de pollen, telle qu’elle a ´et´e r´ealis´ee (r´ecolte, pr´eparation). Ensuite, nous parlons de la pr´ e-paration des autres sp´ecimens que nous avons observ´e (billes de verres microscopiques, objets fins).

5.1.1.1 Pr´eparation des grains de pollens

La pr´eparation des lames contenant des pollen se fait selon la m´ethode utilis´ee par les palynologues3 de Cordoue4 (Espagne). Dans le cadre du projet europ´een A.S.T.H.M.A.5

[ASTHMA 98] dans lequel s’inscrivaient nos travaux, la pr´eparation a ´et´e normalis´ee au niveau de la pr´eparation du colorant utilis´e.

Un pollen est la cellule reproductrice mˆale qui sert `a la reproduction des v´eg´etaux. Les grains de pollen sont produits par les fleurs et pour assurer la reproduction de la plante, il doit ˆetre dispers´es. Il y a plusieurs types de dispersion possibles [Reille 90] (par les insectes, par l’eau ou par le vent), et seule la dispersion par le vent va nous int´eresser. Pour plus de d´etails sur les grains de pollen, voir l’annexe A. Pr´ecisons tout de mˆeme qu’un grain de pollen est un objet 3D.

5.1.1.1.1 R´ecolte Comme nous l’avons dit, nous nous sommes int´eress´es aux pollens qui ont un potentiel allerg´eniques, c’est-`a-dire ceux qui sont dispers´es dans l’air. Un peu partout en France (Fig. 5.1 (a)) et en Europe, les scientifiques ont dispos´e des capteurs polliniques (Fig. 5.1 (b)) qui sont en fait des buses d’aspiration qui aspirent l’air ambiant. Un scotch collant dispos´e sur un tambour qui tourne en fonction du te r´ecup`ere les parti-cules pr´esentes dans l’air. Ce filtre est relev´e de te en te par les palynologues avant d’ˆetre pr´epar´e pour ˆetre observ´e avec un microscope optique.

Cette m´ethode de r´ecolte poss`ede l’inconv´enient de ne pas r´ecup´erer que les pollens, mais aussi les poussi`eres et les moisissures pr´esentes dans l’air [Tomczak 99a]. Une autre m´ethode de r´ecolte qui permet de n’avoir presque que des grains de pollen consiste `a secouer des fleurs directement au-dessus d’une lame.

3. Le palynologue est un sp´ecialiste des pollens, capable de reconnaˆıtre un tr`es grand nombre de vari´et´es diff´erentes.

4. Leur sit Web est disponible `a l’adresse : http://www.uco.es/rea/

5. Advanced System of Teledetection for Healthcare Management of Asthma : syst`eme avanc´e de t´el´ed´ e-tection pour la pr´evention de l’asthme.

5.1. MAT ´ERIEL ET M ´ETHODES 111

(a) le r´eseau fran¸cais de surveillance a´eropollinique en 1999

(b) capteur de pol-len de type Hirst

Fig. 5.1 – Les capteurs polliniques en France. Le nombre de capteurs pr´esents en France en 1999 (a) se restreint `a 1 capteur par d´epartement (chaque point noir sur la carte repr´esente un capteur). Un capteur pollinique (b) est compos´e d’ailerons qui lui permettent de s’orienter dans le sens du vent, et d’une buse d’aspiration. Celle-ci aspire l’air, et un filtre (sorte de tambour muni d’un scotch collant [Dey 99]) r´ecup`ere pollens et particules pr´esents dans l’air.

5.1.1.1.2 Coloration et observation Une fois les pollens sur le scotch, il faut les colorer pour pouvoir les voir. Un pollen non trait´e apparaˆıt trop translucide pour ˆetre ´

etudi´e avec pr´ecision. Il sont trait´es avec une pr´eparation normalis´ee [ASTHMA 98] de fuschine (Fig. 5.2 (b)) ; c’est un colorant de couleur rose qui se pr´esente sous forme de g´elatine `a temp´erature ambiante, et sous forme de liquide si on la chauffe vers 50^◦C. Elle va ˆetre plus ou moins absorb´e par les pollens.

Cette pr´eparation va ˆetre ´etal´ee sur une lame microscopique (Fig. 5.2 (c)) avant d’ˆetre observ´ee avec un microscope optique.

5.1.1.2 Microbilles

Les lames contenant les microbilles sont pr´epar´ees tr`es facilement :

– pour les microbilles qui sont observ´ees `a l’air, elles sont saupoudr´ees sur une lame vierge et observ´ees directement, sans lamelle pour les recouvrir. C’est pour cela qu’il est impossible, si l’on bouge la lame entre deux acquisitions, de retrouver la bonne position de la bille qui nous int´eresse : le fait de prendre la lame, de l’incliner ou

112 CHAPITRE 5. R ´ESULTATS

(a) la diss´emination et le comptage des pollens

(b) flacon de fuchine

(c) ´echantillons de pollens teint´es

Fig. 5.2 – Sch´ema explicatif de la pr´eparation des grains de pollen, depuis la r´ecolte jusqu’`a l’observation. La coloration se fait avec de la fuschine (b) ; on pr´epare une lame avec les pollens (c).

5.1. MAT ´ERIEL ET M ´ETHODES 113

de souffler dessus font se mouvoir les billes. Par contre, une fois la lame positionn´ee sous le microscope, les mouvements des 3 axes (de quelques microns `a chaque fois) sont suffisamment faibles pour que les billes ne bougent pas ;

– pour les microbilles dans de la fuchsine, nous versons de la fuchsine (chauff´ee pour en augmenter sa fluidit´e) sur une lame neuve et nous la saupoudrons de billes avant de rajouter une lamelle. Il faut laisser refroidir le m´elange avant de l’utiliser, car les mouvements de convection de la fuchsine liquide suffisent `a faire bouger les billes.

5.1.1.3 Les autres objets microscopiques

Les images de diaphragmes microscopiques (2D) ne n´ecessitent pas de vraiment de traitement pr´ealable. Il suffit de les d´epoussi´erer `a l’aide d’un souffleur `a air sec et de les placer sous le microscope.