Au d pa t, ous a io s o çu la st at gie d’ide tifi atio des pa te ai es i t a ellulai es ou membranaires du peptide (R/W)9 présentée schématiquement Figure 55.
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Figure 55 : “t at gie i itiale N° e isag e pou l’ide tifi atio des pa te ai es d’i te a tio (intracellulaires et/ou membranaires) du peptide (R/W)9 par photocross-linking. Le protocole correspondant
est présenté dans lapartie matériel et méthodes III.5.
A l’issue de l’i u atio des ellules EF a e le peptide photo R/W9 en mélange équimolaire des formes deutérées et non-deut es, les oîtes de ellules so t pla es da s le o tage d’i adiatio décrit précédemment (cf. Figure 41. A la fi de l’i adiatio les ellules so t la es afi d’ li i e le peptide photo(R/W)9 non internalisé, puis lysées avec un tampon de lyse stringent permettant de solubiliser la quasi-totalité du matériel cellulaire. Ensuite deux approches complémentaires, l’u e à gauche notée branche a.) faisant appel à la purification de complexes entiers et l’aut e à d oite notée branche b.) reposant sur la purification de peptides photocross-linkés obtenus après digestion, doi e t a outi à l’ide tifi atio de pa te ai es.
Da s la a he a., l’identification des partenaires peut se faire avec des moteurs de recherche o e tio els da s la esu e où tous les peptides t psi ues d’u e des p ot i e s pa te ai e s photocross-linkée(s) avec le peptide peuvent être analysés en spectrométrie de masse. Dans la branche de droite, seuls les peptides photocross-li k s so t p se ts à l’issue de la pu ifi atio pa affi it et l’ide tifi atio des pa te ai es de a do passe pa l’utilisatio du logi iel Xli k-Identifier d elopp a e l’ uipe du D . X. Du et mentionné précédemment.
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Etant donné que les deux branches de la stratégie initiale ne conduisent pas aux mêmes résultats (peptides photocross-linkés versus peptides trypsiques de la protéine capturée entière), il convient de présenter successivement les résultats obtenus pour les deux branches.
Branche a : Ci-dessous (Figure 56) est présenté le gel 1D SDS-PAGE o te u à l’ tape .a cf. Figure 55).
Figure 56: Gel 1D SDS-PAGE coloré au bleu de Coomassie. piste 1 : marqueurs de poids moléculaires, piste 2 :
cellules photoirradiées en présence de peptide photo(R/W)9 E ha tillo ν et pu ifi es su illes ; piste 3 : ellules photoi adi es e l’a se e de peptide photo R/W9 (Echantillon CT) et purifiées sur billes ; pistes 4 et : e i o µg de l sats des ha tillo s ν i adi s et CT o t ôle espe ti e e t.
Le gel coloré au bleu de Coomassie ne présente aucune bande pour les pistes 2 et 3 correspondant aux milieux purifiés sur billes. Cela était attendu pour le contrôle (noté CT et déposé piste 3) mais pas pou l’ ha tillo de l sat issu de ellules photoirradiées en présence de peptide photo(R/W)9 (noté ν et d pos piste 2). En effet, les complexes photocross-linkés formés sont en principe purifiés sur
illes ag ti ues de st epta idi e a a t d’ t e lu s et ig s su gel.
E l’a se e de a des d’i t t, le p oto ole ’a pas t pou sui i au delà de l’ tape .
T ois h poth ses p i ipales peu e t t e a a es pou e pli ue l’a se e de a des de protéines:
- Un faible rendement de linking et donc une quantité de complexes photocross-linkés trop faible pour donner lieu à des bandes visibles sur le gel.
- Une grande multiplicit de pa te ai es d’i te a tio se liant avec une affinité moyenne à
faible au peptide photo(R/W)9.
- Une mauvaise capture des complexes photocross-linkés entiers sur billes magnétiques de streptavidine (étiquette biotine portée par le peptide photo(R/W)9 masquée lorsque ce dernier est photocross-linké à une protéine de taille importante). Il est intéressant de noter que ce problème de purification des complexes entiers formés entre un peptide biotinylé et
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pou d’aut es t pes d’appli atio s e utilisa t es es billes magnétiques greffées avec de la streptavidine.
Branche b : Dans le cas de la a he , l’a al se des luats o espo da t au ilieu a tio els digérés puis purifiés sur billes magnétiques de streptavidine est réalisée en MALDI-TOF (étape 6.b). Les résultats sont très reproductibles et donnent lieu à des spectres de masse tel que celui présenté Figure 57.
Figure 57 : Spectre MALDI-TOF o te u pou l’ luat o espo da t au ilieu a tio el ν dig et pu ifi su billes. Matrice utilisée CHCA.
L’i te p tatio du spe t e de asse Figure 57, nous donne les informations suivantes :
- La présence de doublets indique la présence du peptide photo(R/W)9 et/ou d’esp es photocross-linkées.
Les dou lets d’i te sit s les plus le es o espo de t au peptide photo R/W 9 entier (m/z 2392-2402 (1+), 1197-1202(2+)), partiellement digéré (m/z 1720-1730, 1894-1904 ,2237-2247) ou complètement digéré (m/z 1054-1064) et non à des espèces photocross-linkées. Il semblerait que les d te ge ts utilis s pou la l se ellulai e ’aie t pas t o pl te e t li i s, conduisant à une
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pourrait expliquer le faible nombre de doublets de plus haut m/z et leur faible intensité. Quelques doublets de moindre intensité et de m/z supérieurs à ceux du peptide photo(R/W)9 entier sont également visibles (cf. zoom Figure 57. Il pou ait s’agi d’esp es photocross-linkées ou bien d’adduits du peptide photo R/W 9 avec des cations. Etant donné leur faible intensité et la proximité du doublet 2393-2402 correspondant au peptide photo(R/W)9 entier, la largeur de la fenêtre de s le tio de l’io p u seu du MALDI-TOF/TOF est trop importante pour sélectionner correctement
es dou lets d’i t t et o te i des i fo atio s su leu s ue e.
Conclusion : Les résultats o te us pou l’e p ie e alis e selo la st at gie i itiale, ous conduisent à nous poser les questions suivantes:
- Y-a-t-il bien formation de complexes photocross-linkés dans les cellules et avec quel
rendement ?
- Est-il possible de purifier ces complexes photocross-linkés entiers sur billes ?
Ils ous i ite t gale e t à opti ise e tai es tapes du p oto ole à sa oi l’ li i atio des d te ge ts a a t la digestio et la ua tit d’e z e à utilise .
- L’ide tificatio de pa te ai es d’i te actio s sera-t-elle possible avec la branche b à
l’issue de l’opti isatio des co ditio s de digestio ?
C’est su la ase de es p e ie s sultats et des uestio s u’ils o t sus it es ue ous a o s d id de réaliser des expériences complémentaires.