Les méthodes de validation et de caractérisation qui sont présentées dans cette partie sont destinées à des expériences in vitro.
1. Calorimétrie de titrage isotherme (ITC)
La calorimétrie par titrage isotherme (Isothermal Titration Calorimetry ITC) est une technique qui utilise les échanges de chaleur associés à une interaction moléculaire à température constante pour obtenir une caractérisation thermodynamique complète de cette interaction. En 1965, Christensen et
al. o t t les p e ie s à d i e l’ITC o e u e thode permettant de déterminer si ulta e t la o sta te d’ uili e et l’e thalpie asso i e à la fo atio d’u o ple e [157]. Ce système a ensuite été utilisé pou l’ tude d’i te a tio s au sei de s st es iologi ues [158]. Ce
’est u’e ue les p e ie s alo i ètres commerciaux sont apparus.
Un système ITC est classiquement composé, comme schématisé Figure 17, de deux cellules, une cellule échantillon et une cellule de référence contenues dans une enveloppe adiabatique, ainsi que d’u e se i gue o te a t u liga d ui est tit da s la ellule ha tillo o te a t la solutio de protéine.
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Figure 17 : Co figu atio lassi ue d’u alo i t e de titrage isotherme d’ap s Ta i.D “ite
pharmaXchange.info).
Lorsque les deux éléments interagissent de la chaleur est dégagée (réaction exothermique) ou absorbée (réaction endothermique) dans la cellule échantillon. La puissance nécessaire pour maintenir les deux cellules à la même température est mesurée par le calorimètre et traduite en sig al. Lo s ue la p ot i e est satu e pa le liga d ajout , le sig al de haleu di i ue jus u’à e que seule la variation de chaleur liée à la dilution soit observée. La représentation de ces variations de chaleur pour des ajouts de ligands réalisés à intervalles réguliers (Figure 18. A) permet de tracer u e ou e ep se ta t l’ ha ge de haleu e fo tio du atio olai e ligand/protéine. A partir de ette ou e la o sta te d’association (ka = 1/kd , la stœ hio t ie de la a tio de fo atio du o ple e et la a iatio d’e thalpie asso i e peu e t t e p is e t d te i es Figure 18.B . A e es esu es, il est e suite possi le de al ule l’e t opie Δ“ ai si ue ha ge e t d’ e gie li e ΔG a e l’ uatio ΔG = -RTl Ka= ΔH-T Δ“.
Figure 18 : A Do es utes e t aites d’u e e p ie e d’ITC. B Isothe e de liaiso ep se ta t l’ ha ge de haleu e fo tio du atio olai e liga d/p ot i e. d’ap s Ta i.D “ite pha aX ha ge.i fo .
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L’ITC pe et do d’o te i u e a a t isatio the od a i ue o pl te d’u e i te a tio . Cela a conduit à un développement particulièrement rapide de la technique au cours des dernières décennies [159].
Aujou d’hui, l’ITC est utilis e pou tudie tous les t pes d’i te a tio s da s les uelles des p ot i es peuvent être impliquées : les interactions protéine-protéine, les interactions protéine-ADN/ARN et les interactions protéine-petite ol ule. Pa i les appli atio s de l’ITC o peut ite gale e t l’ tude du eplie e t et du d plie e t de p ot i es et les tudes de tit age pa d pla e e t d’u ligand permettant d’a oi a s à la o sta te d’asso iatio d’u liga d de haute affi it [160].
Co t ai e e t à d’aut es thodes, l’ITC e e uie t pas l’i o ilisatio ou la odifi atio hi i ue des p ot i es da s la esu e où l’a sorption ou la production de chaleur sont des p op i t s i t i s ues de uasi e t toutes les a tio s io hi i ues. L’ITC p se te a oi s e tai s i o ie ts puis u’il s’agit d’u e te h i ue a a t is e pa u e fai le se si ilit et qui nécessite pa o s ue t u e o so atio i po ta te d’ ha tillo . C’est, de plus, une technique qui présente un bas débit, ne pouvant être utilisée en routine dans la mesure où les conditions doivent être optimisées pour chaque système étudié.
2. Résonance magnétique nucléaire (RMN)
La RMN, te h i ue as e su l’i te a tio e t e u ha p ag ti ue et des o au ato i ues à spin non nul, a été principalement connue pendant de nombreuses années comme méthode de détermination de structure tridimensionnelle de macromol ules iologi ues. Aujou d’hui, ’est l’ tude des i te a tio s p ot i e-protéine qui donne lieu à la plupart des applications.
Jus u’à p se t la RMN ’a pas t e esu e de i alise a e la istallog aphie au a o s X e termes de résolution notamme t. Cepe da t il se t ou e u’u e tai o e de o ple es importants ne cristallisent pas correctement ou bien que la cristallisation ne se fait pas dans la conformation biologiquement active. Cela est particulièrement le cas pour les interactions faibles et/ou t a sitoi es e t e p ot i es. La RMN p se te ai si l’a a tage pa appo t à la istallog aphie au a o s X, de pe ett e l’ tude des o ple es e solutio s. D’aut e pa t, les a a es technologiques dans le domaine de la RMN ont permis de développe diff e tes thodes d’ tude des complexes qui fournissent des informations complémentaires pour la caractérisation d’i te a tio s p ot i e-protéine.
Pa i elles, l’effet u l ai e O e hause i te ol ulai e Nuclear Overhauser Effect NOE) qui permet de cartographier les interactions biomoléculaires. La technique NOE se base sur la mesure p ise des dista es e t e les t s o eu p oto s d’u o ple e pou ta li la st u tu e tridimensionnelle de ce dernier. Cette technique est seulement applica le lo s ue l’i te a tio e t e deux molécules est suffisamment forte (Kd < 10 µM).
Nous pouvons citer également la technique de cartographie par perturbation du déplacement chimique (Chemical shift Perturbation Mapping) qui est la technique la plus utilisée pour définir les i te fa es e t e p ot i es. B i e e t, ette te h i ue epose su l’e egist e e t de spe t es HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence) 15N-1H d’u e p ot i e au fu et à esu e de l’ajout
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d’u pa te ai e o a u ui a e i odifier les déplacements chimiques de la protéine de d pa t. U e e ple de spe t es H“QC pou e t pe d’e p ie e est p se t Figure 19.
Figure 19 : Exemple de spectres 1H-15N H“QC de l’i te leukin-2 (IL- e p se e leu et e l’a se e a o d’u e petite ol ule i hi it i e de IL-2 (Figure tirée de [161]). La position de certains signaux est
significativement modifiée suite à l’ajout de la petite ol ule i hi it i e : Ces signaux correspondent à des acides aminés faisant partie de la zo e d’i te a tio a e les i hi iteu s.
Cette méthode est sensible et permet de repérer des changements assez subtils. Par exemple, elle a permis de montrer que les domaines doigts de zinc des protéines peuvent, en plus de leur fonction de liaiso de l’ADN, induire des interactions protéine-protéine avec de relativement faibles affinités (10-5 M) [162].
Un troisième exemple de technique faisant appel à la RMN pour la caractérisation de complexes est le titrage par RMN (titration with NMR). Cette technique, en plus de permettre de cartographier l’i te fa e d’i te a tio , do e u e o e esti atio de l’affi it , de la stœ hio t ie, de la sp ifi it et des pa a t es i ti ues de l’i te a tio . U o e e ple d’appli atio est le t a ail réalisé avec la troponine C qui est une protéine liant le calcium ainsi que la troponine I et qui est impliquée dans la régulation musculaire [163]. Le titrage par RMN a révélé que deux équivalents de calcium pouvaient lier la troponine C avec une haute affinité. Au cours de ce processus, la troponine C passe d’u tat la ge e t d st u tu à la fo atio d’u do ai e apa le d’i te agi a e la troponine I. En présence de deux atomes de calcium, la troponine C lie un fragment de troponine I a e u e stœ hio t ie : et u e o sta te d’affi it de ± µM.
Il a récemment été montré que la RMN pouvait permettre de mettre en évidence des changements conformatio els de l’o d e de la illise o de [164].
Cepe da t, la RMN p se te l’i o ie t de o so e des ua tit s i po ta tes de at iel iologi ue, de l’o d e du illig a e pa a al se, et e pe et d’a al se ue des i te a tio s a e u e affi it fai le de l’o d e du illi olai es ou de uel ues i o olai es.
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3. Cristallographie aux rayons X
La cristallographie aux rayons X est la technique la plus résolutive pour étudier la structure t idi e sio elle de io ol ules e phase solide. Cette te h i ue pe et, e effet, d’o te i des i fo atio s st u tu ales à l’ helle ato i ue. L’ tude p ise de la st u tu e de es ol ules pe et ai si d’ide tifie les zo es d’i te a tio ent e diff e tes ol ules ais aussi d’ide tifie d’ e tuels sites de fi atio de liga ds de s th se. Ai si la istallog aphie au a o s X a t t s utilis e da s l’i dust ie pha a euti ue pou la o eptio de liga ds de haute affi it . Cepe da t elle s’est o t e à plusieu s ep ises i suffisa te pou o e te e t p oi les elatio s st ucture-activité et doit ainsi souvent être couplée à des méthodes donnant accès à des informations thermodynamiques indispensables à une prédiction correcte des interactions [165]. L’o te tio de cristaux diffractants et la nécessité de dispose de ua tit s i po ta tes d’ ha tillo s este t les principales limitations de cette technique [166].
4. Spectrométrie de masse native
Les te h i ues d’io isatio le t osp a E“I et de d so ptio io isatio lase assist e pa at i e MALDI so t des thodes d’io isatio ualifi es de « douces » et permette t d’o te i e phase gaz des ions de biomolécules de hautes masses moléculaires. Cependant, il apparaît que la technique MALDI est oi s adapt e à l’ tude d’i te a tio s p ot i e-protéine et protéine-ligand dans la mesure où les conditions de matrice utilisées viennent perturber ces interactions. Différentes thodes, telles ue l’utilisatio de o ditio s pa ti uli es pou l’o te tio des istau de at i e, peu e t t e ise e œu e pou o tou e ette diffi ult et tudie des o ple es o -covalents en MALDI [167]. Cepe da t aujou d’hui le te e de spe t o t ie de asse ati e fait
ajo itai e e t f e e à l’E“I.
Depuis 1991, la spectrométrie de masse avec une ionisation de type électrospray (ESI-MS) a été au œu de t a au de e he he i te ses isa t à d eloppe u e appli atio ie pa ti uli e, à sa oi l’ tude de complexes non-covalents. En spectrométrie de masse classique aussi appelée spectrométrie de masse moléculaire, les espèces ionisées sont présentes en phase gaz dans le spectromètre de masse sous forme individuelle après la destruction des liaisons non-covalentes existant en solution. En revanche la spectrométrie de masse supramoléculaire ou native a pour objectif de transférer les complexes moléculaires intacts, ’est-à-di e tels u’ils p e iste t e solution, e s la phase gaz de l’i st u e t. Au p e ie a o d u e te h i ue essita t le t a sfe t des espèces en phase gaz peut sembler inappropriée pour étudier des assemblages de molécules maintenus par des interactions faibles (liaisons électrostatiques, interactions de Van der Waals, liaisons hydrogènes et hydrophobes) et donc intrinsèquement fragiles. Cependant au début des années 1990 deux groupes américains ont été les premiers à montrer que des interactions protéine-liga d pou aie t su i e au p o essus d’io isatio le t osp a [168], [169] (cf. Figure 20). A noter cependant que les interactions hydrophobes ne sont pas conservées lors de la désolvatation.
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Figure 20 : Spectres de masse obtenus en infusion avec une source électrospray et permettant de suivre l’h d ol se de l’he asa ha ide de N-acétylglycosamine (NAG6 pa le l zoz e de la d’œuf de poule (HEWL). Le mélange de HEWL (3,17.10-5 M) et NAG6 (4,41.10-4 M da s le ta po a tate d’a o iu M à pH 5 est infusé dans la source électrospray à un débit de 2 µL/min. Les spectres de masses présentés sont obtenus respectivement à 1 min (A), 10 min (B) et 60 min (C). L’a o da e du pi o espondant au complexe (HEWL+NAG6)8+ (m/z =1943,3) diminue en intensité au fur et à mesure du temps alors que celle du pic correspondant à (HEWL+NAG4)8+ (m/z=1892,2), p oduit d’h d ol se, aug e te (Figure tirée de [168])
Depuis cette découverte, différents laboratoires ont travaillé à la mise au point de conditions e p i e tales pe etta t de p se e la st u tu e uate ai e des p ot i es et d’ tudie la topologie des complexes et leur dynamique de manière reproductible.
La mise au point des conditions expérimentales commence par le tampon. Généralement, les tampons utilisés pour les purifications et les extractions de protéines ou de complexes non-covalents contiennent des sels non volatils (tampon phosphate, tris ou HEPES) qui ne sont pas compatibles a e l’io isatio le t osp a . Ai si la p e i e tape, esse tielle pou l’a al se de o ple es o
-o ale ts e spe t -o t ie de asse, est l’ ha ge du ta po de pu ifi atio lo s d’u e étape de
dessalage. Le nouveau tampon doit remplir deux conditions : t e o pati le a e l’io isatio le t osp a et pe ett e de p se e l’i t g it du o ple e o o ale t. Ce so t les ta po s a o iu a tate d’a o iu , a o ate d’a o iu , t i th la o iu ui so t les plus adapt s. Ils pe ette t d’a oi u pH o p is e t e et , et leu fo e io i ue peut t e adapt e en fonction de la stabilité des complexes en faisant varier leur concentration entre 5 et 500 mM.
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Un autre point crucial pour maintenir les édifices non-covalents lors du processus de désorption et d’io isatio des o ple es est le réglage des paramètres du spectromètre de masse qui contrôlent l’ e gie o u i u e au io s lo s du p e ie stade de po page da s l’i st u e t. Cette gio de pression intermédiaire est appelée interface et correspond physiquement à la zone des premiers he apoles. Les pa a t es à opti ise so t la p essio de l’i te fa e Pi ui affe te l’effi a it des collisions et le oltage d’a l atio V e o e appel e te sio ô e ui o t ôle l’ e gie i ti ue do e au io s da s la sou e de l’i st u e t [170]. Les paramètres Vc et Pi doivent être optimisés simultanément de manière à obtenir le meilleur compromis possible entre la désolvatation des ions, la transmission des ions de hauts m/z et la conservation des complexes non covalents. E fi , l’ tude de o ple es o -covalents par spectrométrie de masse native requiert l’utilisatio d’u analyseur capable de mesurer avec une bonne résolution de hautes valeurs de ratio m/z. Les instruments temps-de-vol (TOF : Time-Of-Flight) et les analyseurs hybrides quadripolaire-TOF (Q-TOF) sont particulièrement bien adaptés pour les expériences de spectrométrie de masse native car ils com i e t haute se si ilit , haute solutio , itesse d’a uisitio et la ge ga e de asse (théoriquement illimitée) [171], [172].
Aujou d’hui la spe t o t ie de asse ati e o stitue u outil o uste ui est de plus e plus utilis pou l’ tude de o ple es o -covalents de différentes natures (protéine/protéine, protéine/ligand, protéine/métal, protéine/ARN, protéine/ADN, etc...).
La spe t o t ie de asse ati e e pe et pas d’o te i d’i fo atio s d taill es su la st u tu e ol ulai e et ato i ue des o ple es, ais a u o e i po ta t d’a a tages par rapport aux techniques de biophysiques traditionnelles (RMN, calorimétrie de titration isotherme, cristallographie aux rayons X), telle que sa sensibilité (analyse de complexes protéiques disponibles en quantités picomolaires), sa rapidité, sa capacité à mesurer simultanément différentes espèces d’u la ge. Elle p se te gale e t l’a a tage de pou oi sui e e di e t des ha ge e ts alis s e solutio ajout de liga d, ajout de p ot i e . Fi ale e t elle pe et d’o te i des do es apitales da s l’ tude de o ple es à sa oi la stœ hio t ie des complexes, la spécificité des i te a tio s ai si ue les aleu s des o sta tes d’affi it elati es [173].
Ai si la te h i ue de spe t o t ie de asse ati e est u outil de hoi pou l’ tude in vitro de complexes protéiques purifiés.
5. L’ ha ge h d og e/deut iu HDX
L’ ha ge h d og e/deut iu oupl à la spe t o t ie de asse Hydrogen deuterium
exchange-mass spectrometry HDX-MS) est devenu une technique clé pour le suivi des changements
dynamiques de structure des protéines en solution. La possibilité de réaliser des échanges hydrogène/deutérium pour étudier la structure des protéines a été mise en évidence par Kaj Ulrik Linderstrøm-Lang da s les a es ais les p e ie s sultats d’ tude de p ot i es pa HDX-MS
’o t t pu li s u’e [174].
Cette app o he epose su le fait u’u e p ot i e e o ta t a e de l’eau lou de deut e D2O) va échanger ses atomes d’hydrogènes o t e des deut iu s. L’ ha ge h d og e/deut iu se a quasi-instantané pour les hydrogènes labiles, comme ceux des amines primaires par exemple. Les
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protons amides du s uelette p ot i ue o t, eu , des i ti ues d’ ha ges plus lentes (de quelques minutes à quelques jours) qui varient en fonctions de la conformation et de la dynamique de la région de la protéine dans laquelle ils se trouvent. Ainsi, les hydrogènes des fonctions amides des régions désordonnées et en contact avec le solvant, c'est-à-dire ceux qui ne sont pas impliqués dans des liaisons hydrogènes stables, vont être échangés rapidement contre des deutériums. Par contre, ceux de zones bien repliées, associées entre elles de manière stable, vont être bien mieux protégés de ces échanges H/D.
La plupart des expériences HDX-MS sont réalisées en conditions de marquage continu (continuous
labelling strategy) pour lesquelles le niveau de deutération des protéines est fonction du temps
d’e positio au D2O. L’o je tif de ces études est de détecter les modifications de structure induites par un stimulus externe telle u’u e odifi atio hi i ue ou la liaiso d’u liga d. Au out de diff e ts te ps t g ale e t de uel ues i utes à uel ues heu es , l’ ha ge H/D est stoppé par une acidification brutale du milieu (pH~2) et une baisse de la température (~0°C) afin de réduire l’ ha ge i e se, c'est-à-di e le e pla e e t d’u deut iu d’u e fo tio a ide pa u hydrogène. Ensuite, une protéase fonctionnelle en conditions acides telle que la pepsine est ajoutée afin de réaliser une protéolyse limitée. Les peptides obtenus sont dessalés et séparés en chromatographie en phase inverse et analysés en spectrométrie de masse. Même en conditions acides et à basse température il est diffi ile d’ ite totale e t l’ ha ge i e se. Ai si, il faut fai e en sorte que la digestion et la séparation chromatographique soient réalisées en un minimum de te ps. La alisatio d’a al ses de spe t o t ie de asse e ta de est essai e pour l’ide tifi atio des peptides issus de la digestio à la pepsi e ui alise des oupu es o spécifiques.
Ensuite le taux de deutération pour les différents peptides est calculé aux différents temps t de l’e p ie e selo la fo ule sui a te:
A e t la asse o e e du peptide d’i t t, et les asses du peptide pou des échantillons de référence respectivement complètement ou pas du tout marqués.
Différentes alternatives à e p oto ole i itial d’e p ie e HDX-MS basée sur une approche bottom-up ont rapidement été développées. Des expériences HDX-MS dites pulsées ont également été mises au point par Konermann et al. et sont utilisées pour détecter et caractériser des intermédiaires ayant u e du e de ie ou te de l’o d e de la s .
L’app o he top-do est e t e e t p o etteuse da s le do ai e de l’HDX-MS [175] car elle pe et de pallie les p o l es d’ ha ges i e ses D H pouvant avoir lieu pendant la protéolyse ui o duise t ota e t à la pe te d’i fo atio su les groupements amines N-terminaux qui subissent systématiquement cet échange.Concernant la méthode de fragmentation, il faut savoir que la technique CID peut présenter des biais en induisant des processus de « scrambling » qui viennent complètement modifie l’e p ei te H/D g e. Il faut pa o s ue t utilise préférentiellement des te h i ues d’io isatio as es su les le t o s telles ue l’ECD et l’ETD ui pe ettent de o se e l’i fo atio . Ce t pe d’e p ie e asso ia t l’ hange hydrogène-deutérium pulsé à la
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spectrométrie de masse top-do a e f ag e tatio ETD a t is e œu e a e su s pou l’ tude d’u e fo e i te diai e de l’apo oglo i e e ista t lo s de so eplie e t [176]. Les al uls des tau de deut atio pou les diff e tes pa ties de la p ot i e o t pe is d’o te i le graphique ci-dessous pour des pulses à différents temps et ainsi suivre le repliement de la protéine (Figure 21).
A e l’a i e de s st es o otis s pe etta t de alise e lig e toutes les tapes de l’e p ie e