Comme indiqué dans la Figure 39, à l’issue de la photoi adiatio , u e pa tie du ilieu a tio el est digérée à la trypsine et purifiée sur billes magnétiques de streptavidine de façon à isoler les peptides photocross-linkés. Les peptides piégés sont ensuite élués avec une solution acide. Dans le as d'u e a al se MALDI, l’ lutio est alis e a e la at i e CHCA pe etta t ai si u dépôt direct sur une plaque MALDI. Dans l'éventualité d'une analyse par nanoLC-ESI-MS/MS, l'élution est réalisée a e u e solutio d’HCl , M o pati le a e u e s pa atio Na oLC.
a. Analyse en spectrométrie de masse MALDI-TOF/TOF.
Analyse MS
L’a al se du ilieu réactionnel peptide photo(R/W)9-BSA en ratio 1-1 (20 µM-20 µM), obtenu par photoi adiatio i sui ie d’u e digestio t psi ue et d’u e pu ifi atio su illes magnétiques de streptavidine, donne le spectre de masse présenté Figure 42.
Figure 42 : Spectre MALDI-TOF (gamme de m/z 1000-3000) obtenu pour le milieu réactionnel de photocross-linking entre photo(R/W)9 et la B“A à l’issue de la digestio t psi ue et de la pu ifi atio d’affi it . Matrice
utilisée CHCA. Le doublet 2803-2813 correspond aux formes deutérées et non-deut es d’u peptide photocross-li k . Il est e ad e leu a ous allo s utilise l’e e ple de sa f ag e tatio da s la suite de ce manuscrit.
Dans ce spectre MALDI-TOF, seuls des ions sous forme de doublets sont observés. Ceci indique que seules les espèces photocross-linkées ou le peptide n'ayant pas réagit ont été enrichis dans ce mélange à l'issue de la purification d'affinité biotine/streptavidine. Le doublet pic de base correspond au peptide photo(R/W)9da s sa e sio la plus ou te o te ue ap s digestio pa la t psi e ’est-à-dire au motif Biot-G5(1H/2H)-K(pBz)-R et indique que la réaction de photocross-li ki g ’est pas totale. Nous observons de nombreux doublets correspondant à des peptides photocross-linkés. Ces dou lets o t u e i te sit alla t jus u’à % de l’i te sit du pi de ase pou e tai s, indiquant que la réaction présente un rendement satisfaisant dans ces conditions. La réaction de photomarquage précédemment décrite conduit à la formation d'un complexe covalent dont la masse
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G5(H/ H)-K(pBz)-R du CPP photo(R/W)9 et le peptide trypsique issu de la BSA. Cette hypothèse de travail nous a permis de générer facilement avec un tableur Excel, la liste des peptides photocross-linkés théoriques et d'attribuer les doublets du spectre MALDI-TOF (Tableau 7). Cela nous a permis d’o te i ota e t u e h poth se o uste su l’ide tit du peptide photo oss-linké correspondant au doublet 2803- . Il s’agi ait de la s ue e EC!C!HGDLLEC!ADDR (avec toutes les cystéines sous forme carbamidométhylée C!) de la BSA covalemment liée au motif Biot-G5(1H/2H) –K(pBz)-R. Ceci a été possible grâce à la bonne précision de la mesure de masse (<20 ppm pour des masses allant jusqu'à 3000 Da) et à une liste de peptides photocross-linkés potentiels relativement restreinte du fait du partenaire protéique unique et connu.
Pou l’ ha tillo o t ôle gatif, à sa oi photo R/W 9 + BSA (1:1) sans photoirradiation, aucun doublet hormis celui correspondant au peptide photo(R/W)9dig , ’est o se .
Tableau 7 : Attribution des doublets observés dans le spectre MALDI-TOF présenté (Figure 42). Les valeurs
expérimentales et théoriques des m/z des doublets sont présentées dans les deux premières colonnes. Le delta de masse est donné dans la 3ème colonne. Les peptides trypsiques de photo(R/W)9 et de la BSA sont présentés dans les colonnes suivantes. Le symbole ! indique une modification dynamique, ici la carbamidométhylation des cystéines.
Analyse MS/MS
L’ tude des spectres de fragmentation des doublets correspondant aux formes deutérées et non-deutérées des peptides photocross-li k s s’est a e pa ti uli e e t i t essa te pou caractériser les séquences photomarquées de la BSA et éventuellement, quand cela est possible pour définir le site de photocross-li ki g. Nous allo s d taille l’e e ple du dou let -2813 encadré en bleu sur la Figure 42.
Avec le spectromètre de masse MALDI-TOF/TOF (4700 Proteomic Analyzer, Applied Biosystems), la fenêtre de sélection utilisée ne permet pas de sélectionner uniquement un des deux ions du doublet pour la fragmentation. Il est possible dans certains cas, de déplacer cette fenêtre de sélection vers les plus hautes masses (m/z > 2813) ou les plus basses masses (m/z < 2803) pour ne fragmenter qu'un seul des deux ions, mais ceci au détriment de la qualité des spectres MS/MS puisqu'une quantité d'ions non négligeable est perdue lors de cette opération. Nous avons donc choisi de fragmenter simultanément les ions 2803 et 2813 en réglant la fenêtre de sélection sur le rapport m/z 2809 et en choisissant une faible résolution R = 30. Le spectre MS/MS obtenu est présenté Figure 43.
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Figure 43 : Spectre de fragmentation MALDI-TOF/TOF du doublet de peptides photocross-linkés 2803-2813.
Matrice utilisée CHCA.
Sur le spectre de fragmentation nous pouvons immédiatement constater que certains fragments sont sous forme de doublets (d) et d'autres sous forme de singulets (s). Les ions doublets correspondent à des fragments contenant le motif Biot-G5(1H/2H) tandis que les ions singulets ne le contiennent pas. Parmi eux, le pic de base à m/z 1054-1064 correspond à la masse du motif Biot-G5(1H/2H)-K(pBz)-R et résulte de la rupture de la liaison C-C formée entre la benzophénone et la protéine BSA. La rupture préférentielle de cette liaison peut traduire une certaine fragilité de la liaison C-C formée du fait de l’i po ta te o t ai te st i ue li e à la p se e des deux cycles benzéniques de la benzophénone (Figure 44).
L’att i utio a uelle des f ag e ts (Figure 43) du spectre représenté, nous a permis de déterminer que, dans le cas du peptide EC!C!HGDLLEC!ADDR, la liaison covalente implique une des deux leucines de la séquence. Le fragment de m/z 1693, o espo da t à u e uptu e e le Cα et le Cβ de la
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Figure 44 : Représentation schématique de la structure potentielle de l'ion du peptide photocross-linké correspondant au doublet 2803-2813. Attribution manuelle du spectre de fragmentation MALDI-TOF/TOF.
E e ple a e l’h poth se d’u e liaiso o ale te su la deu i e leu i e de la s ue e de la B“A. Les a es verticales bleues correspondent aux sites de fragmentation. Les barres horizontales vertes claires sont pour les ions b, et les vertes foncées pour les ions y. (s) pour un ion singulet et (d) pour un doublet.
Tableau 8 : Attribution des fragments du spectre MALDI-TOF/TOF présenté Figure 43. Les valeurs des m/z
pour les fragments singulets ou doublets sont données dans la première colonne. Le type de fragment b ou y, cross-linké ou non, est indiqué dans la deuxième colonne. Les morceaux de séquence correspondant aux fragments sont indiqués dans les troisième et quatrième colonnes. Le symbole @ donne la position du site de photocross-li ki g i i l’h poth se d’u e liaiso su la deu i e leu i e est p opos e . Le s ole ! indique une modification dynamique ici la carbamidométhylation des cystéines.
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