o pte. Le ilieu au sei du uel s’ ta lit l’i te a tio p ot i e-protéine (nucléoplasme) peut être différent de celui où résident naturellement les protéines (cytoplasme, milieu extracellulaire, e a e, o pa ti e t su ellulai e… e ui peut d’e l e i flue su le fait ue les p ot i es o t e t e ou o e o ta t le pH, l’ tat edo , le t pe d’io s et leu o e t atio ai si ue d’aut es fa teu s joue t u ôle i po ta t da s les i te a tio s . L’e i onnement nucléoplasmique des protéines qui ne sont pas forcément nucléaires peut atténuer, ou, au contraire, favoriser les interactions entre protéines. Enfin pour interagir avec un partenaire, certaines protéines doivent subir des modifications post-t adu tio elles phospho latio , a t latio … essita t des e z es sp ifi ues d’u t pe ellulai e do ou a a t u e lo alisatio pa ti uli e.
Ainsi parmi toutes les protéines candidates à une exploration sur le principe du double hybride chez la le u e, e tai es lasses de p ot i es se p te t al ou t s al à l’app o he lassi ue, les protéines membranaires surtout mais aussi les protéines fibrillaires et certains facteurs transcriptionnels (de par leur aptitude potentielle à activer la transcription).
Des méthodes alternatives peuvent être utilisées. Elles jouent sur le choix du type cellulaire ou sur le site su ellulai e où se d oule l’i te a tio .
Cellules hôtes
c.
Le test original a été développé avec des levures mais théoriquement toutes les cellules sont sus epti les de se i de tu e à essai pou la d te i atio d’i te a tio s p ot i e-protéine. Les cellules mammifères communément utilisées appartiennent généralement à des lignées telles que CHO, COS [102], HEK-293, Hela, NIH 3T3.
2. Résonance plasmonique de surface (Surface plasmon resonance, SPR)
La technique de SPR a été pour la première fois utilisée comme biocapteur par Leidberg et al. en 1983 [103]. Cette méthode permet de détecter la formation de complexes en suivant des ha ge e ts d’a gle d’i ide e ou d’i te sit d’u fais eau lu i eu o o h o ati ue lo s d’u e réflexion totale. Les pa te ai es d’u e p ot i e do e e solutio i te agisse t a e la p ot i e
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d’i t t fi e de faço o ale te ou o su u fil o ga i ue d’u e paisseu de , lui-même lié à une surface métallique de faible épaisseur.
Les phénomènes physiques impliqués dans la détection de partenaires sont complexes. On peut les détailler comme suit : La fle io totale d’u fais eau lase à l’i te fa e e e/ tal g e u e os illatio de de sit d’ le t o s uasi-libres (plasmon) du métal. Cette oscillation de densité génère à son tour une onde électromagnétique évanescente se propageant sur une épaisseur de ~100 nm à pa ti de l’i te fa e. Toute modification de composition dans cette épaisseur (protéine avec et sans partenaires) entraîne une modification de la fréquence de la résonance plasmonique et donc une modification de la réflexion initiale (angle et/ou intensité).
Une expérience de SPR se déroule ainsi classiquement de la manière suivante : u liga d d’i t t (un peptide ou une protéine par exemple) est immobilisé covalemment sur un polymère de dextran lui- e fi o ale e t su u e su fa e e o et e pos au flu d’u e solutio de p ot i es o te a t des pa te ai es d’i te a tio pote tiels. Les p ot i es ui i te agisse t a e e liga d sont retenues à la su fa e du pol e et o t i dui e u e odifi atio de l’a gle de so a e de la lu i e e ha gea t l’i di e de f a tio au fu et à esu e de leu a u ulatio pa i te a tio a e le liga d d’i t t. Cette odifi atio de l’a gle de so a e se traduira par une diminution de l’i te sit du sig al pou l’a gle de so a e i itial. U s h a de p i ipe de la te h i ue est présenté Figure 9.
Figure 9 : Schéma de principe de la résonance plasmonique de surface (SPR) d’ap s le site http://elte.prompt.hu)
Il e iste u e elatio li ai e e t e la di i utio de l’i te sit pou l’a gle de so a e et la concentration en protéine à la surface. Ainsi il est possible de déterminer la consta te d’asso iatio ka e sui a t l’ olutio du sig al de “PR au ou s du te ps o e s h atis Figure 10. La constante de dissociation kd peut également être mesurée en lavant la surface avec le tampon seul. Ensuite, la constante de formation du complexe peut être obtenue K=ka/kd.
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Figure 10 : Rep se tatio s h ati ue d’u e esu e de “PR d’ap s le site http://elte.p o pt.hu
Les articles de Malmqvist [104] et de Jonsson et al. [105] constituent de bonnes références pour ceux ui souhaite t a oi u e e pli atio plus d taill e su l’utilisatio de la “PR pou l’ tude d’i te a tio i ol ulai es ta dis ue l’a ti le de Ka lsso [106] reprend les différentes équations traduisant ces phénomènes.
U dispositif as su la “PR pou l’ tude d’i te a tio de io olécules est commercialisé depuis 1984 sous le nom de Biacore. Cet appareil présente plusieurs avantages [13]: (1) il nécessite peu de matériel biologique. Typiquement seulement 1 à 10 µg de protéine doivent être immobilisé sur la pu e ui peut e suite t e utilis e jus u’à fois ap s li i atio des protéines adhérentes. (2) La thode est t s apide, de l’o d e de i pou u e e p ie e. Cette te h i ue e nécessite aucune modification préalable des protéines c'est-à-dire aucun marquage par des étiquettes d’affi it ou fluo es e tes. Des interactions peuvent être mises en évidence même da s des la ges o ple es de p ot i es. A la fois les o sta tes d’asso iatio et de dissociation peuvent être obtenues rapidement. (6) Cette méthode est applicable à une large gamme de concentrations en protéines.
La SPR a été utilisée avec succès pour suivre des interactions peptide-protéine et a permis, par exemple, de d te i e l’i te a tio de diff e ts do ai es “H a e deu peptides d i s du facteur de croissance des plaquettes (PDGF) porteurs de phosphorylations de leur acides aminés tyrosine [107].
Cette technologie peut être utilisée pour mieux caractériser des interactions protéine-protéine déjà connue en déterminant la constante de formation de ce complexe protéique mais peut également pe ett e d’isole de ou eau pa te ai es d’i te a tio qui, une fois élués et digérés, seront identifiés par spectrométrie de masse en tandem. Kikuchi et al. [108] ont montré la faisabilité de ce t pe d’app o he dite de « ligand fishing » pou l’ide tifi atio de ou eaux partenaires de la protéine p53. La SPR fait ainsi également partie des méthodes pouvant conduire à la découverte de nouvelles interactions protéines-protéines.
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Le couplage avec la spectrométrie de masse (MS) peut être indirect (élution des partenaires) ou direct (analyse en MALDI de la puce biocapteur). Compte tenu des écarts de sensibilités des deux te h i ues ~ g e “PR et g e M“ leu ouplage este aujou d’hui e o e d li at e deho s des interactions anticorps–antigène.
3. Blue Native PAGE
La technique blue native polyacrymalide gel electrophoresis (BN-PAGE ite d’ t e e tio e pa i les thodes de d ou e tes d’i te a tio s p ot i e-protéine. La technique Blue Native PAGE (BN-PAGE) mise au point par Schägger et al. [109] reprend le principe du gel SDS-PAGE qui permet de séparer les protéines en fonction de leur taille. Au lieu des molécules de SDS qui se fixent aux protéines et leur confèrent une charge n gati e e les d atu a t, ’est le leu de Coo assie G ui va permettre, dans le cas de la technique BN-PAGE, de charger négativement les protéines mais sans les dénaturer. Il est également possible avec cette technique de maintenir des interactions non-co ale tes et do d’isole des o ple es p ot i ues. Cette te h i ue a ai si t utilis e pou ta li des interactions protéine-p ot i e. Elle s’est, pa e e ple, l e t s utile pou tudie les complexes de respiration des mitochondries chez les plantes ou chez la levure [110], [111].
A l’issue de la s pa atio su BN-PAGE qui permet de déterminer la masse des protéines dans leur tat atif, de d fi i les tats d’oligo isatio et d’ide tifie des i te a tio s p ot i e-protéine, il est possible de réaliser (1) une extraction des protéines par électroélution et une immunodétection après électrotransfert, (2) une migration dans une seconde dimension en SDS-PAGE ou même (3) une ig atio da s u e se o de di e sio e le t ofo alisatio IEF sui ie d’u e s pa atio pa “D“-PAGE dans une troisième dimension. Ainsi les sous-unités des complexes isolés en BN-“D“-PAGE peuvent être dissociées et pourront être identifiées par la suite par spectrométrie de masse par exemple [112].
4. M thodes de pu ifi atio d’affi it couplées à la spectrométrie de
masse (AP-MS)
Les thodes de d ou e tes de pa te ai es d’i te a tio as es su la pu ifi atio pa affi it consistent dans un premier temps à isoler une p ot i e d’i t t l’appât ainsi que ses partenaires d’i te a tio les p oies grâce à une molécule immobilisée sur un support solide (une résine par ex.)
ui a pe ett e de les aptu e . Da s u deu i e te ps les pa te ai es d’i te a tio isol s o t être identifiés par spectrométrie de masse.
Ai si es app o hes de pu ifi atio d’affi it couplées à la spectrométrie de masse sont g ale e t d sig es pa l’a o e AP-MS (Affinity Purification coupled with Mass
Spectrometry).
Nous allo s tout d’a o d ous fo alise su les diff e tes thodes de pu ifi atio d’affi it a a t d’a o de l’identification des partenaires capturés par spectrométrie de masse.
Au ou s des de i es a es, les thodes de pu ifi atio d’affi it o t e tu plusieu s fo es e raison du développement de nombreux protocoles adaptés à différents contextes biologiques.
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On distingue deux grandes familles de protocoles e fo tio de l’o d e des e e ts :
- “oit la p ot i e d’i t t appât est pu ifi e su le suppo t d’affi it e e te ps ue ses pa te ai es d’i te a tio : o pa le d’immunoprécipitation.
- Soit la p ot i e d’i t t est d’a o d i o ilis e su le suppo t d’affi it et e suite ise e p se e d’u la ge o ple e de p ot i es o te a t des pa te ai es pote tiels : on pa le alo s d’u p oto ole de pull-down.