Nous ous so es e suite i t ess s à l’a al se du e échantillon avec le spectromètre de masse ESI-LTQ-Orbitrap XL de la plateforme. En effet, ce système couplé à une chaîne NanoLC et dot d’u e g a de solutio est desti à l’a uisitio haut d it de do es et apa le d’isole efficacement et automatiquement des espèces pour les fragmenter. Avec ce système nous avons pu obtenir des spectres de fragmentation CID basse énergie et ETD pour tous les peptides photocross-li k s de l’ ha tillo . A e e t pe d'appa eil, seul u des io s du dou let est s le tionné pour être fragmenté.
Nous avons fait appel à l’outil asstag du logi iel d’a uisitio X ali u de manière à fragmenter
u i ue e t les io s isi les sous fo e de dou lets a e des pi s d’i te sit s p o hes et espa s de 10,06 Da dans les spectres MS. Ceci permet d'optimiser le temps imparti à la fragmentation en ne fragmentant que les espèces pertinentes. Au-delà de la sélection des espèces d'intérêt à fragmenter, le fait d’a oi à la fois les spe t es M“/M“ des e sio s lou des et l g es d’u peptide facilite l’a otatio des spe t es de fragmentation. Cependant l’att i utio a uelle reste fastidieuse même dans le cas de partenaires connus et est donc inenvisageable dans le cas de partenaires d’i te a tio s i o us présents dans des milieux complexes tels que des lysats cellulaires, par exemple.
Nous avons essayé de contourner le problème en recherchant les espèces photocross-linkées analysées en NanoLC-ESI-MS/MS avec les moteurs de recherche SEQUEST et MASCOT. Pour cela, nous avons défini la partie Biot-G5(1H/2H)-K(pBz)-R de ces espèces comme une modification existant sous deux formes, lourde et légère, et pouvant impliquer n'importe lequel des 20 résidus. En effet, la a tio de photo a uage peut e t aî e la fo atio d’u e liaiso C-C entre la benzophénone et le pa te ai e su ’i po te uel sidu.
A chaque fois, nous avons pu constater que les ions correspondant aux peptides photocross-linkés, bien que très majoritaires dans le spectre MS après enrichissement sur billes de streptavidine, ne faisaient pas partie de la liste des peptides identifiés avec un FDR < 1 %. Par contre, nous avons pu, pa e e ple, t ou e la pai e d’io s - pa i les peptides ide tifi s a e u FDR > % ’est à di e eu ui so t lassi ue e t ejet s pou l’identification des protéines (cf. tableaux de peptides identifiés pour la BSA en annexes N°1).L’e e ple a e l’h poth se de la liaison sur la leucine est donné Figure 45.
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Figure 45 : Peptides correspondant à la protéine BSA (P02769) identifiés lors de la recherche avec Mascot de l’a al se Na oLC-ESI-MS/MS du milieu de photocross-linking photo(R/W)9-BSA. Les deux dernières lignes
correspondent aux ions du doublet 2803-2813. Ils sont identifiés avec les modifications notées RW9p ou RW9pR0 correspondant à la partie Biot-G5(1H/2H)-K(pBz)-R sous forme légère ou lourde avec des scores, respectivement, de 16 et de 20 et font ainsi partie des peptides avec un FDR > 5 % (points rouges).
Les moteurs de re he he lassi ues e so t do pas e esu e d’att i ue u s o e correctement aux peptides photocross-linkés lo s ue l’u e des pa ties est d fi ie o e u e modification. Ce problème pourrait être lié au fait que plusieurs ions fragments obtenus résultent de f ag e tatio s au sei de ette odifi atio , possi ilit ui ’est pas e isag e da s la d fi itio des modifications pour les moteurs de recherche classiques. Ainsi, de nombreux ions ne sont pas attribués, conduisant à des scores trop faibles pour être pris en compte dans les résultats avec un FDR < 1 %.
Pou e e à ie ot e st at gie d’ide tifi atio de pa te ai es i t a ellulai es pa photo oss-linking, il nous faut impérativement être en mesure d’i te p te les spe t es de f ag e tatio des peptides photocross-linkés, rapidement et automatiquement, pour à la fois identifier le partenaire et la zo e d’i te a tio . Nous a o s alo s fait appel au ioi fo ati ie s de l’ uipe du D . Xiu ia Du, avec laquelle nous avions préalablement travaillé pou l’i te p tatio des do es de oss-linking chimique [280], pour développer une nouvelle version du logiciel Xlink-Ide tifie apa le d’ide tifie les espèces photocross-linkées.
Ce logiciel a été écrit par Adam Baxter en réalisant les étapes suivantes : Identification des peptides photocross-linkés
Génération des listes de précurseurs (peptides photocross-li k s sus epti les d’ t e observés à partir des fichiers d’e te sio .fasta de la protéine BSA et de celui créé pour photo(R/W)9.
Comparaison de la liste des précurseurs fragmentés observés avec la liste théorique des p u seu s g e à l’ tape p de te Identification des peptides photocross-linkés sur la base des ratios m/z des précurseurs (mesure en haute résolution et haute précision en masse).
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Génération de listes de candidats : Pour chaque peptide photocross-linké identifié il y a autant de site de cross-linking potentiels que de résidus dans le peptide trypsique issu de la protéine qui a été liée covalemment au peptide photoactivable.
Par exemple, pour la forme non-deutérée du peptide photocross-linké comprenant la séquence de la BSA notée ECCHGDLLECADDR (14 résidus) et o espo da t à l’io M+H + m/z 2803, nous obtenons une liste de 14 candidats pour un spectre MS/MS acquis (Figure 46).
Figure 46 : Liste de candidats obtenus avec Xlink-Identifier pour le peptide photocross-linké (M+H)+ m/z 2803. Colonne 1 : score calculé par Xlink-Identifier, fonction du nombre de fragments attribués dans le spectre
MS/MS ; colonne 2 : erreur en ppm sur la masse du précurseur ; colonne 3 : (M+H)+ de l’io p u seu ; colonne 4 : f e e du spe t e M“/M“ a uis et tat de ha ge de l’io f ag e t i i spe t e M“/M“ , ions 4+) ; colonne 7 : numéro du candidat. Les colonnes suivantes font référence aux séquences des deux espèces liées covalemment. Le symbole @ visible dans les colonnes 9 et 12 indique la position du site de photocross-linking.
Génération de listes de fragments pour chacun des candidats susceptibles de correspondre au peptide photocross-linké. Dans le cas des peptides photocross-linkés il faut considérer 4 types de f ag e ts uel ue soit le ode de f ag e tatio CID ou ETD . A tit e d’e e ple, es f ag e ts sont schématisés sur la Figure 47 pour le mode de fragmentation CID, c'est-à-dire avec génération de fragments b et y. Ces fragments, dans la nomenclature utilisée par Xlink-Identifier sont dits "unlinked" si l'ion correspondant est un peptide linaire et "interlinked" si l'ion correspondant est un peptide branché.
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Figure 47 : Schéma des différents fragments b et y (fragmentation CID) pouvant être obtenus à partir d'un ion précurseur composé de deux peptides liés covalemment par photocross-linking, dont l'un contient une biotine en N-terminal. N.B: la biotine est considérée comme un résidu classique.
Comparaison des listes de fragments des différents candidats avec les spectres MS/MS acquis pour un peptide photocross-li k . Att i utio d’u s o e à ha ue a didat su la ase des pi s identifiés. Les différents ions observés et leur attribution sont présentés Figure 48 pour un des candidats (n°1733) correspondant à l'ion précurseur 4+de l’io de M+H+ m/z 2803.
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Figure 48 : Exemple de fichier candidat répertoriant les pics identifiés dans un spectre MS/MS donné (ici le N°8450) correspondant à un peptide photocross-linké (ici (M+H)+ m/z 2803). N.B. : le premier résidu de
chaque séquence peptidique est numéroté zéro.
En guise de remarque, on peut noter que le score attribué à un candidat constitue une information i t essa te pou l’ide tifi atio du site de photo oss-li ki g. Elle ’est alg tout pas suffisa te pour trancher sur la position du site de photocross-linking car :
1) Tous les types de fragments sont traités de la même manière : en effet, le spectre d'un ion interlinked avec peu de fragments mais informatifs pourra avoir un score plus faible qu'un spectre comportant de nombreux ions fragments non informatifs sur la localisation du site de photomarquage ;
2) Plusieurs candidats peuvent avoir des scores similaires.
En travaillant sur les listes de fragments, nous avons cherché à établir une procédure pour restreindre à quelques, voire à un seul dans l'idéal, le nombre de résidus potentiellement impliqués dans la réaction de photocross-linking. Cette procédure est schématisée Figure 49.
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Figure 49 : Procédure d'identification du (ou des) résidu(s) potentiellement impliqué(s) dans la réaction de photocross-linking. Les parties gauche (lettres jaunes) et droite (lettres oranges) de la procédure font
respectivement référence au traitement des résultats obtenus pour les versions légères, non-deutérées et pour les versions lourdes, deutérées des peptides photocross-linkés. A l’ tape A, le candidat qui présente le meilleur score (cf Figure 46 est s le tio . A l’ tape B, les fragments les plus informatifs (B1 : fragments non cross-linké, B2 : fragments cross-linkés) quant à la position de la liaison sont déterminés et permettent de restreindre le nombre de sites de photocross-li ki g pote tiels. A l’ tape C, les listes de résidus restants parmi les possibilités c'est-à-dire les résidus potentielle e t li s pa la e zoph o e, so t fusio es. A l’ tape D, les listes obtenues pour les versions légères et lourdes des peptides photocross-linkés sont confrontées.
Nos olla o ateu s t a aille t a tuelle e t à l’ itu e du ode pou ette p o du e ai si u’à l’i te façage du logi iel. Le logi iel, en cours de mise au point, de ait t e e esu e d’i te p te à la fois les spectres obtenus en utilisant les modes de fragmentations CID et ETD, ce qui devrait fa ilite l’ide tifi atio des sites de photocross-linking. En effet, les méthodes de fragmentation CID et ETD reposent sur des mécanismes bien distincts qui donnent naissance à des fragments également différents et génèrent donc des informations complémentaires.
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