Expériences d’i u op cipitatio
Il a plusieu s tapes u i e selles da s u e e p ie e d’i u op ipitatio ui so t list es i-dessous et illustrées par la Figure 11.
(1) L’o te tio , la p pa atio de ellules ou de tissus o te a t la p ot i e d’i t t sous fo e e dog e ou po teuse d’u e ti uette.
(2) La lyse des cellules ou du tissu et la solubilisation des complexes protéiques grâce à des tampons de lyse adaptés (conditions non dénaturantes pour préserver les complexes). (3) L’isole e t de la p ot i e d’i t t et de ses pa te ai es d’i te a tio pa pu ifi atio
d’affi it .
(4) L’ lutio des o ple es p ot i ues pu ifi s.
(5) L’a al se des p ot i es isol es pa spe t o t ie de asse pou l’ide tifi atio / a a t isatio et la ua tification des interactions protéine-protéine.
Figure 11 : Des iptio s h ati ue des tapes u i e selles d’u e e p ie e d’i u op ipitatio couplée à la spectrométrie de masse [113]:
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Les p oto oles d’i u op ipitatio a ie t e fo tio de la p ot i e appât utilisée au départ qui peut être soit endogène, soit porter une étiquette (epitope tag), mais qui peut également avoir été modifiée par deux étiquettes distinctes comme pour les expériences de TAP-tag.
Pu ificatio d’affi it avec u e p ot i e e dog ne
L’i u op ipitatio a e u e protéine endogène epose su la apa it d’isole la p ot i e appât su u suppo t pa l’i te diai e d’u a ti o ps sp ifi ue de ette p ot i e. L’a a tage de ette méthode est la possibilité de capturer la protéine dans son état, avec une abondance physiologique et en interaction avec ses partenaires pour une multitude de systèmes (cellules, tissus, modèles animaux) sans avoir besoin de réaliser de clones ou de marquage.
Les inconvénients sont la disponibilité, la spécifi it et l’affi it des a ti o ps utilis s pou e o aît e la p ot i e d’i t t. La a ti it ois e et le oût de es a ti o ps o stitue t sou e t un frein à leur utilisation.
Pu ificatio d’affi it avec u e p ot i e po teuse d’u e ti uette epitope tag)
E alte ati e à l’utilisatio de la fo e e dog e de la p ot i e, il est f ue t de fai e appel à u e étiquette (epitope tag). Ces étiquettes sont de courtes séquences peptidiques qui ont une forte affinité avec des anticorps. Elles sont généralement dérivées de gènes viraux ce qui explique leur forte immunoréactivité. De nombreuses étiquettes ont déjà été utilisées pour les expériences d’i u op ipitatio [114], [115]. Parmi elles, se trouvent des peptides étiquettes tels que le FLAG, 6 histidines (His)6, c-M et l’h agluti i e ou des ti uettes de tailles plus importantes telles que la protéine fluorescente verte (green fluorescent protein GFP) ou la glutathione-S-transférase (GST). Les étiquettes les plus communes ainsi que leurs caractéristiques sont rassemblées dans le Tableau 1.
Tableau 1 : Etiquettes communément utilisées en pu ifi atio d’affi it (Figure d’ap s [114]).
L’ ti uette est fusio e à la p ot i e e i s a t le g e de ette p ot i e da s le e teu contenant le gène coda t pou la s ue e de l’ ti uette o e illust da s la Figure 12.
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Figure 12 : O te tio d’u e p ot i e e o i a te po teuse d’u e ti uette (site olympusmicro.com
rubrique epitope tagging)
La thode de pu ifi atio d’affi it a e u e p ot i e po teuse d’u e ti uette est i d pe da te des propriétés de liaison de la protéine et peut donc être appliquée à la fois à des protéines de forte ou de faible abondance. Cette approche est généralement plus robuste car les conditions expérimentales sont optimisées pour une étiquette donnée qui peut être ensuite utilisée pour étudier différentes protéines. Un inconvénient de cette méthode est le temps nécessaire à l’o te tio de la p ot i e de fusio ui doit être générée et introduite dans le système biologique d’i t t. De plus, il est t s i po ta t de alide la p ot i e « taggée » de manière à confirmer que l’ ti uette ’i te f e i a e la fo tio de la p ot i e e dog e, i a e sa lo alisatio ou ses propriétés [116].
Méthode de purification en tandem TAP-tag (double tag)
Ta dis ue les thodes de pu ifi atio d’affi it o po ta t u e seule tape o t fait leu s p eu es pour la capture d’i te a tio s p ot i ues de fai le i te sit et de fai le a o da e, les te h i ues de pu ifi atio d’affi it e ta de o t t i itiale e t i t oduites pou p se e les i te a tio s stables tout en réduisant les interactions non spécifiques [117].
La première expérience de TAP-tag schématisée Figure 13 tait as e su l’utilisatio d’u e p ot i e po teuse d’u e dou le ti uette : u peptide lia t la al oduli e Calmoduline Binding Peptide CBP) sui i d’u e u it IgG de la p ot i e A de Staphylococcus aureus (PrA) et reliés par une séquence peptidique correspondant au site de clivage par la protéase TEV. La protéine de fusion o espo da te et ses pa te ai es d’i te a tio so t pu ifi s à pa ti d’e t aits ellulai es pa u e première sélection sur une matrice IgG. Après différents lavages, la protéase TEV est ajoutée pour li e la p ot i e de fusio de so suppo t. L’ luat est e suite i u a e des illes g eff es par de la al oduli e e p se e de al iu . Cette se o de tape de pu ifi atio d’affi it pe et d’ li i e la p ot ase TEV ai si ue les t a es de o ta i a ts esta tes ap s la p e i e pu ifi atio . A l’issue de nouveaux lavages, la protéine de fusion et ses partenaires stables sont élués a e de l’EGTA ethylene glycol tetraacetic acid) qui va chélater les ions calcium et induire un changement de conformation de la calmoduline permettant la libération de la protéine de fusion.
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Figure 13 : “ h a de l’e p ie e de TAP-tag initiale (Figure tirée de [117]).
Bien que faisant référence au départ à la combinaison spécifique des étiquettes peptidiques de la prot i e A et de la al oduli e d elopp e pa l’ uipe de “ aphi , le te e de pu ifi atio TAP-tag est aujou d’hui utilis pou d i e toutes les te h i ues ui fo t appel à deu ti uettes et à deu tapes de pu ifi atio d’affi it su essi es. D’e ellents articles de revue décrivent les différentes stratégies employées [118], [119]. Il est i po ta t de ga de à l’esp it ue la taille relativement importante de ces tags et de leurs connexions aux régions N- ou C-terminales peuvent o pli ue fo te e t l’i te p tatio et la filiatio des o eu pa te ai es. Il peut ai si t e utile de comparer les résultats obtenus en plaçant ces tags soit en N-, soit en C-ter de la protéine.
Expériences de pull-down
Dans une expérience de pull-down, la protéine appât qui porte une étiquette est immobilisée sur un support par le biais de cette étiquette. Un support « d’affi it se o dai e » est ainsi généré pour la purification de protéines partenaires de la protéine appât. Ce support sur lequel est immobilisée la protéine appât est incubé avec un milieu contenant un mélange complexe de protéines partenaires pote tielles tel u’u l sat ellulai e. Cette thode est plus si ple à ett e e œu e a elle e nécessite pas for e t d’e p i e u e p ot i e de fusio po teuse d’u e ti uette. E effet, l’ ti uette peut t e ajout e à la p ot i e ap s sa pu ifi atio . E e a he, il se peut ue la fi atio préalable de la protéine appât entraîne une contrainte conformationnelle de celle-ci conduisant au as uage d’u ou plusieu s sites d’i te a tio de ette p ot i e a e so ou ses pa te ai es de liaison. Cette méthode est également applicable à des petites molécules de synthèse, peptides ou autres, dans lesquelles une étiquette telle u’u e ioti e peut a oi t i t oduite. L’utilisatio de e t pe de st at gie desti e à o p e d e l’effet d’u e petite ol ule e se asa t su
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l’ide tifi atio de ses pa te ai es d’i te a tio po te le o de protéomique chimique (chemical
proteomics) [120].