M ATERIEL ET M ETHODES
III. Méthode de biologie moléculaire 1 Extraction d’acides nucléiques
III.2. Polymerase Chain Reaction : PCR
La PCR est par définition une réaction en chaîne permettant d’amplifier in vitro une région spécifique d'un acide nucléique donné, afin d'en obtenir une quantité suffisante pour le détecter et l’étudier.
Le mélange réactionnel de PCR est composé d’ADN polymérase, de tampon apportant les conditions nécessaires au fonctionnement de l’enzyme, de dNTP permettant à l’enzyme de synthétiser les fragments d’ADN complémentaires, d’un couple d’amorces permettant de cibler un locus génique à amplifier (Tableau 2), d’une matrice d’ADN, et d’eau ultrapure afin d’ajuster les concentrations des différents réactifs.
Malgré des variations spécifiques des enzymes et mélanges réactionnels utilisés, les réactions de PCR se déroulent selon le principe suivant :
• Une étape de dénaturation initiale entre 95°C et 98°C et de durée variable, permettant de dénaturer les molécules d’ADN doubles brins en molécules simples brins.
• 30 à 35 cycles composés d’une étape de dénaturation entre 95 et 98°C, une étape d’hybridation des amorces dont la température est variable en fonction de ces dernières (Tableau 8), et une étape d’élongation permettant aux ADN polymérases de synthétiser les fragments d’ADN complémentaires.
• Une étape d’élongation finale est appliquée aux réactions de PCR à l’issue des cycles d’amplification.
Tableau 8 : Amorces utilisées au cours de cette étude pour les expériences de PCR en point final.
Amorces Séquences (5’-3’) Cible Source
Myco F GGCAAGGTCACCCCGAAGGG Gène rpoB de
Mycobacterium spp.
(Adékambi et al., 2003)
Myco R AGCGGCTGCTGGGTGATCATC
RPOID-1 GACGACATCGACCACTTCGG Gène rpoB de
Mycobacterium spp
(Delafont et al., 2014)
RPOID-2 GGGGTCTCGATCGGGCACAT
Ami6F1 CCAGCTCCAATAGCGTATATT Gène codant l’ARNr
18S des amibes
(Thomas et al., 2006)
Ami9R GTTGAGTCGAATTAAGCCGC
TM6SCI_34F GGCGTGCTTAACACATGC
Gène codant l’ARNr 16S de Vermiphilus pyriformis Cette étude TM6SCI_443F CTCTAATACAGATGAAGGAT TM6SCI_1035R GTGCAAATGTCTAAGTAAAC TM6SCI_1516R GCAGGTTCTCCTACAGCTAC
III.3. PCR quantitative (PCRq)
La technique de PCR quantitative repose sur le même principe que la PCR, mais apporte la possibilité de quantifier le nombre de copies d’un gène ciblé par mesure de fluorescence. Les expériences de PCR quantitative ont été réalisées en utilisant les chimies SYBR Green et TaqMan.
Le SYBR Green est une molécule de la famille des cyanines asymétriques, qui s’intercale entre les bases d’un fragment d’ADN double brin. Lors de sa fixation, elle émet une fluorescence à 530 nm. Cette fluorescence est mesurable et permet de donner une estimation de la quantité d’ADN matrice initialement présente dans l’échantillon, car la fluorescence est proportionnelle à cette dernière.
La chimie TaqMan repose sur l’utilisation d’une sonde nucléotidique complémentaire à une région flanquée par les amorces utilisées. Cette sonde possède la particularité d’être doté d’un fluorochrome émetteur (Reporter) en 5’, et d’un fluorochrome suppresseur (Quencher) en 3’. Lorsque la sonde est intègre, la fluorescence émise par le Reporter est absorbée par le Quencher. Lorsque l’ADN polymérase synthétise le brin complémentaire de l’ADN ciblé, son activité éxonucléase 5’à3’ va hydrolyser la sonde, désolidarisant ainsi le Reporter, qui va pouvoir émettre une fluorescence mesurable.
Une valeur de cycle seuil est mesurée (Crossing point, Cp), correspondant au cycle de PCR à partir duquel la fluorescence mesurée est supérieure au bruit de fond. Plus la quantité d’ADN est importante dans l’échantillon avant l’amplification, plus le nombre de cycles nécessaires au franchissement du seuil sera faible.
III.3.1. Réalisation de la gamme étalon
La droite étalon représente les valeurs de Cp obtenues expérimentalement en fonction du logarithme décimal des concentrations en ADN cibles fixées, issues de la série de dilution d’un échantillon standard. La valeur de Cp est inversement proportionnelle au Log10 de la concentration initiale en molécules cibles.
Les concentrations en ADN des extractions de cultures pures de M. chelonae et d’Acanthamoeba castellanii ATCC 30234 ont été déterminées, puis converties en Unité Génome (UG) par µL en fonction de la taille du génome du microorganisme d’intérêt, soit 5,27x106 pb pour M. chelonae et 45x106 pb pour A. castellanii. La gamme étalon a été
préparée en réalisant des dilutions décimales en série.
III.3.2. Amplification
Les réactions de PCRq ont été effectuées avec un thermocycleur Viia7 (Life Technologies), en utilisant les kits TaqMan® Fast Virus 1-Step Master Mix et SYBR® Green PCR Master Mix (Life Technologies). Les réactions ont été effectuées dans un volume final de 20 µL, comprenant les amorces à 500 nM chacune, 200 nM de sonde dans le cadre des qPCR utilisant la chimie TaqMan, 2 µL d’échantillon d’ADN et le mélange réactionnel de PCR comprenant le fluorochrome (lors de l’utilisation de la chimie SYBR Green), les dNTP, la Taq polymérase et les ions nécessaires à son activité, selon les recommandations du fournisseur. Les différentes amorces et sondes utilisées au cours de cette étude sont listées dans le tableau 9.
Une réaction de PCRq comporte les mêmes étapes qu’une PCR classique, cependant une étape supplémentaire appelée « courbe de fusion » est effectuée dans le cadre d’une qPCR utilisant la chimie SYBR Green. Celle-ci consiste à dénaturer les échantillons à 95°C
!
pendant 5 secondes, puis 65°C pendant 1 minute, suivi d’une incrémentation de la température de 65°C à 95°C. Lorsque la température de fusion du fragment d’ADN est atteinte, la fluorescence du SYBR Green est alors perdue. A partir de ce principe, la courbe permet de vérifier la spécificité de l’amplification.Tableau 9 : Amorces et sondes nucléotidiques utilisées au cours de cette étude pour les expériences de qPCR.
Amorces Séquences (5’-3’) Cible Source
FatpE CGGYGCCGGTATCGGYGA Gène atpE de Mycobacterium spp. (Radomski et al., 2013) RatpE CGAAGACGAACARSGCCAT PatpE ACSGTGATGAAGAACGGBGTRAA Amo_1400F ATGCCGACCARSGATYMGGAG
Gène codant l’ARNr 18S des Amoebozoa
et Vahlkampfiidae
(Le Calvez et al., 2012)
Amo_1540R CAAGSTGCYMGGGGAGTCAT
Vahl_560F AGGTAGTGACAAGMYRTAGYGACT
Vahl_730R GGGCGTTTTAACTACARCAGTATTA
Mll_peg1152_ndk_F AGCTGGCGACCAAGCACTAC Gène ndK de M.
llatzerense Cette étude Mll_peg1152_ndk_R TCGACGATGGCAGCCACAAC
Mll_peg5571_ptpa_F TCCGCATGATGCGCTCGTTC Gène ptpA de M.
llatzerense Cette étude Mll_peg5571_ptpa_R AATCGTCGATGCCGCCGTAG
Mll_peg150_PPE10_F TGGCAATGCCGGTGTGGATG Gène ppe10 de M.
llatzerense Cette étude Mll_peg150_PPE10_R AGCAAGGCCGAATGCACCTC
Mll_peg1752_Rv3707c_F GTTCCTGGCACATCGCAACTTC Gène rv3707c de M.
llatzerense Cette étude Mll_peg1752_Rv3707c_R AGTTCTCCCGGTTGATGCTCAC
Mll_peg3132_cut2_F GCTCGGCGGTTACTCATTGG Gène cut2 de M.
llatzerense Cette étude Mll_peg3132_cut2_R CGGGCTGTTGAAGGTGAACG
Mll_peg3860_glya1_F GGCTCGGTGATGACCAACAAG Gène glyA1 de M.
llatzerense Cette étude Mll_peg3860_glya1_R GATGGCGAGTTGCTCTGTGAC
Mll_peg1675_phop_F ACCCACGAGGTGTGGAAAG Gène phoP de M.
llatzerense Cette étude Mll_peg1675_phop_R GCCCGCGTTGATGATGAAG
Mll_peg1462_fbpa_F GCCCTTCCTGGTCAACATCTC Gène fbpA de M.
llatzerense Cette étude Mll_peg1462_fbpa_R ATGTCGTCGGCCTTGTAGC
Mll_peg4455_seca2_F CACGCGAAACTGGTCAAGG Gène secA2 de M.
llatzerense Cette étude Mll_peg4455_seca2_R GTCGTTCTTGGCGTTCAGC
Mll_peg5695_ptpb_F TTTCGATGCTCGCCGACTCC Gène ptpB de M.
llatzerense Cette étude Mll_peg5695_ptpb_R TGAATCCGGTGCGGTCCTTG
Mll_peg4567_esxg_F CTCGGCAGTCGCGTTCCAG Gène esxG de M.
llatzerense Cette étude Mll_peg4567_esxg_R GTCGAGCAGGGCGTTGACC
Mll_peg4567_esxg_F TGGCAGGCCCAGTGGAAC Gène esxH de M.
llatzerense Cette étude Mll_peg4567_esxg_R TCGTGGGTGGTCGCCATC
Mll_16S_F GGCCTTCGGGTTGTAAACCTC Gène codantl’ARN 16S
de M. llatzerense Cette étude