Phylogénie des séquences aoxB et AoxB de souches connues

Quelle que soit la méthode utilisée, distances ou parcimonie, la topologie des arbres est très proche malgré de légères modifications, indiquant que les relations entre les séquences aoxB ou AoxB des bactéries AsIII-oxydantes du domaine Bacteria sont particulièrement fiables. En conséquence, seuls les arbres construits à l’aide de la méthode des distances Neighbor-Joining sont présentés dans le reste de l’étude.

Une comparaison des arbres construits à partir des séquences nucléotidiques et protéiques est présentée Figure 40. Les topologies de ces deux arbres présentent de nombreuses similitudes. Notamment, la séquence de Chloroflexus aurantiacus est clairement séparée des séquences de

Proteobacteria (avec une valeur de bootstrap de 100%, dans les deux cas), les séquences d’α

-Proteobacteria sont séparées des séquences de γ-/β-Proteobacteria (avec une valeur de bootstrap de 97% ou 100%) et de nombreuses branches à l’intérieur de ces groupes sont communes aux deux arbres. Les séquences de souches d’un même genre (e.g. Alcaligenes,

Pseudomonas et Thiomonas) forment des groupes définis dans les deux arbres. Rhine et al.

(2007) ont rapporté que les gènes aoxB des souches chimioautotrophes forment un groupe distinct de ceux des souches chimiohétérotrophes, à l’exception d’Agrobacterium

tumefaciens, et suggèrent que ces deux groupes aient évolué séparément à partir d’un ancêtre

commun. Cependant, notre étude contredit cette observation car les gènes aoxB de la souche

chimioautotrophe Thiomonas arsenivorans sont affiliés à ceux de souches

chimiohétérotrophes et non à ceux de souches chimioautotrophes des α-Proteobacteria. Plus de données sur les gènes aoxB de souches pures oxydant l’AsIII en condition chimioautotrophe et chimiohétérotrophe sont nécessaires pour élucider l’évolution de ce gène. Des différences sont également mises en évidence, notamment au niveau des embranchements d’H. arsenicoxydans, des γ-Proteobacteria (Acinetobacter et Pseudomonas spp.) et des souches du genre Thiomonas. En effet, les souches du genre Thiomonas forment une branche séparée des autres β-Proteobacteria sur l’arbre aoxB, alors qu’elles sont sur la même branche qu’H. arsenicoxydans dans l’arbre AoxB. Les séquences nucléotidiques aoxB de γ

-Proteobacteria se retrouvent affiliées à celles de souches du genre Alcaligenes, alors que les

Figure 40 : Comparaison des arbres phylogénétiques Neighbor-Joining construits à partir de 32 séquences partielles nucléotidiques aoxB (1069 nucléotides) ou protéiques AoxB (350 acides aminés) de bactéries AsIII-oxydantes. Les valeurs de bootstrap supérieures à 50% (sur un total de 100

Les séquences protéiques sont généralement utilisées pour reconstruire la phylogénie de gènes codant des protéines (Scala et al., 1999 ; Case et al., 2007). Elles permettent de distinguer des espèces plus divergentes et d’éliminer les « bruits » créés par de multiples substitutions, lesquelles sont à l’origine d’artefact de reconstruction (Yamamoto and Harayama, 1996). L’utilisation de séquences nucléiques est plus adéquat pour les analyses plus fines (au niveau espèces ou sous-espèces) (Rotthauwe et al., 1997). Puisque les séquences protéiques apparaissent plus résolutives et moins biaisées que les séquences nucléotidiques pour des analyses de séquences moins conservées, les reconstructions phylogénétiques suivantes ont été réalisées sur des séquences protéiques AoxB.

Les phylogénies basées sur les séquences protéiques AoxB de 350 et de 163 résidus d’acides aminés (déduites à partir de ~1000 et ~500 pb, obtenues à l’aide des amorces m1-2F/m2-1R et m1-2F/m3-2R respectivement) ont été également comparée (Figure 41). Les topologies obtenues avec ces séquences de tailles différentes sont similaires. En effet, seulement deux branchements diffèrent : (i) la séquence AoxB de Thiomonas sp. WJ-68 est clairement séparée de celle des autres souches de Thiomonas dans l’arbre basée sur 163 résidus, alors qu’elle est affiliée à T. arsenivorans dans l’arbre basé sur 350 résidus, (ii) les séquences de γ

-Proteobacteria (Acinetobacter et Pseudomonas spp.) sont clairement séparées de celles des γ -/β-Proteobacteria dans l’arbre basé sur 163 résidus.

Figure 41 : Comparaison des arbres phylogénétiques Neighbor-Joining construits à partir de 32 séquences protéiques AoxB partielles (350 acides aminés) et des séquences protéiques AoxB partielles (163 acides aminés) des bactéries AsIII-oxydantes. Les valeurs de « bootstrap » supérieures à 50%

De nombreuses autres séquences aoxB plus courtes (~ 500 pb) sont disponibles dans les banques ou ont été obtenues lors des essais par DGGE (celles de T. arsenivorans et Leptothrix sp. S1.1), mais elles n’ont pas été prises en compte dans les analyses décrites ci-dessus. Pourtant, elles représentent une même région du gène aoxB, celle approximativement encadrée par le couple d’amorce m1-2F/m2-1R. Une analyse phylogénétique AoxB sur 163 résidus a donc été réalisée en prenant en compte toutes ces séquences (Figure 42). Les séquences de souches d’un même genre sont groupées ensemble. Par exemple, la séquence AoxB de Variovorax sp. 4-2 présente 94% d’identité avec celle de Variovorax sp. RM1. Celles des trois souches du genre Achromobacter présentent plus de 96% d’identité entre elles et celles des quatre souches du genre Agrobacterium présente entre 93 et 99% d’identité entre elles. Par contre, les deux séquences AoxB de T. arsenivorans présente 53,1% d’identité en entre elles. L’une est correctement positionnée au sein de celles du groupe Thiomonas spp., tandis que l’autre séquence AoxB obtenue à partir de la bande 2 du profil DGGE présente 91,7% avec celle de Pseudomonas sp. 72. Les deux séquences de Leptothrix sp. S1.1 présente également un faible pourcentage d’identité entre elles (40%). Et la seconde séquence obtenue à partir de la bande 1 du profil DGGE de Leptothrix sp. S1.1 présente 91,7% d’identité avec celle de Bosea sp. WAO. Ces résultats indiquent l’occurrence probable de transferts horizontaux de gènes aoxB (c.f. paragraphe suivant).

La souche AsIII-oxydante, Ancylobacter sp. OL1 (Rhine et al., 2007), possède également deux gènes aoxB, mais ces derniers partagent un pourcentage d’identité élevé. La présence de plusieurs copies de gènes de fonction par cellule a également été montrée pour d’autres groupes bactériens fonctionnels, tels que ceux impliqués dans l'oxydation de l'ammonium via les gènes amo (Norton et al., 1996, Klots et al., 1997), l’oxydation des alcanes via les gènes

alk (Whyte et al., 2002), et en particulier dans la réduction de l’AsV via le gène arsC retrouvé

en quatre exemplaire chez H. arsenicoxydans (Muller et al., 2007). Ces résultats suggèrent donc la présence de plusieurs opérons dans les cellules de T. arsenivorans et Leptrothrix S1.1, avec différents types de régulation.

Figure 42 : Arbre phylogénétique Neighbor-Joining construit à partir de 50 séquences protéiques AoxB (145 acides aminés) de 47 bactéries AsIII-oxydantes. Les valeurs de « bootstrap »