V. La structure et la quantité des gènes aoxB sont-elles liées aux
V.4. Abondance des gènes aoxB
Une absence de substances inhibitrices dans ces eaux a été montrée par l’obtention, en moyenne, de 2,9 x 106 (±6,5 x 105) copies de gènes aoxB contre 1,1 x 106 (±1,1 x 106) copies attendues, dans une réaction contenant 106 copies du plasmide standard pYI025-5 en plus de l’ADN environnemental. Des résultats similaires ont également été obtenus à partir de 20 ng ou 0.2 ng d’ADN cible. Par contre, les tests de PCR en temps réel avec les mêmes concentrations d’ADN cible en présence de 107 copies du plasmide standard du gène codant d’ARNr 16S ont montré des pourcentages d’inhibition variable selon les échantillons : 0 (YI009 et YI020) ; 2,8 (YI025); 4,6 (YI019) ; 12 (PZR10) ; 36,1 (YI011) ; 39,1 (YI016) ; 50 (AB001). Par conséquent, les quantités de gènes codant l’ARNr 16S obtenues dans ces eaux et indiquées dans le Tableau 28 ont été corrigées avant d’être comparées à celles des gènes aoxB.
Dans les huit eaux, le nombre de copies de gènes aoxB varie entre 8,1 x 10 3 (± 1,1 x 10 3) et 1,6 x 105 (± 3,6 x 104) par ng d’ADN (Tableau 28). Au sein de l’échantillon d’eau souterraine et fortement polluée par l’As, les communautés bactériennes dotées de gènes aoxB sont peu représentées. La communauté AsIII-oxydante ciblée est aérobie et son développement dans l’eau souterraine est certainement freiné par la faible concentration en oxygène dissous. Les communautés dotées de gènes aoxB sont en effet plus denses dans les eaux de surface oxiques. Les valeurs les plus élevées sont obtenues pour les eaux oxiques les plus polluées en As : YI011 (polluée par l’AsV) et YI025 (polluée par l’AsIII). Aucune corrélation claire n’est cependant mise en évidence entre la spéciation de l’As et le nombre de copies de gènes aoxB.
Afin d’évaluer la représentativité de ce groupe fonctionnel au sein de la communauté bactérienne totale, l’abondance des gènes aoxB a été rapportée à celle des gènes codant l’ARNr 16S. Le nombre de copies de gènes codant l’ARNr 16S est similaire dans l’ensemble des eaux et varie entre 4,8 x 105 (± 4,8 x 103) et 1,2 x 106 (± 4,9 x 104) ng d’ADN. Comme observé pour les gènes aoxB, le plus faible ratio est obtenu dans l’échantillon d’eau anoxique PZR10 et les plus fort dans les eaux YI011 (polluée par l’AsV) et YI025 (polluée par l’AsIII) où il représente respectivement 13,5 et 11,5% de la population totale (Tableau 28). Cependant, ces pourcentages ne sont que des estimations. En effet, si le nombre de gènes
aoxB par cellule est proche de celui obtenu par PCR en temps réel (en présumant que les
bactéries AsIII-oxydantes possèdent 1 à 2 copies de ce gène, c. f. chapitre 3), le nombre de copies de gènes codant l’ARNr 16S, quant à lui, ne peut être directement corrélé au nombre de cellules, car il varie entre 1 et 15 copies par cellule bactérienne (Fogel et al., 1999 ; Klappenbach et al., 2000). Néanmoins, Salmassi et al. (2006) ont montré, via la méthode du MPN (most probable number), que les bactéries AsIII-oxydantes représentaient 6 à 56% des membres cultivables d’une communauté de biofilm d’un affluent de la rivière Owen (CA, USA), le Hot Creek, fortement pollué par l’As. Les proportions de bactéries AsIII-oxydantes retrouvées dans les eaux du bassin de l’Isle semblent donc raisonnables.
Eaux Nb. copies de gènes aoxB /ng d’ADN Nb. copies de 16S / ng d’ADN Ratio aoxB /16S (%) YI009 1,8 x 104 (± 9,0 x 102) 6,5 x 105 (± 4,9 x 104) 2,8 YI011 1,6 x 105 (± 3,6 x 104) 1,1 x 106 (± 4,9 x 104) 13,5 YI016 2,9 x 104 (± 4,2 x 10 3) 5,9 x 105 (± 2,7 x 104) 4,9 YI019 6,1 x 104 (± 1,3 x 104) 8,3 x 105 (± 3,9 x 104) 7,3 YI020 3,4 x 104 (± 7,3 x 103) 4,8 x 105 (± 4,8 x 10 3) 7,1 YI025 7,5 x 104 (± 4,1 x 103) 6,5 x 105 (± 4,8 x 104) 11,5 AB001 2,1 x 104 (± 4,9 x 103) 1,2 x 106 (± 4,9 x 104) 1,8 PZR10 8,1 x 103 (± 1,1 x 103) 8,4 x 105 (± 9,8x 104) 1,0 Tableau 28 : Nombre de copies de gènes aoxB et de gènes codant l’ARNr 16S dans les échantillons d’eau du bassin de l’Isle. Les mesures de PCR en temps réel sur les huit échantillons d’eaux ont été réalisées sur trois réplicats. La courbe de calibration des gènes aoxB a été développée à
partir de dilutions du plasmide pYI025-5 (c.f. chapitre 1). La courbe de calibration générée pour quantifier les gènes codant l’ARNr 16S est indiquée Figure 27.
V.5. Conclusion
Les approches de DGGE et de PCR en temps réel appliquées aux gènes aoxB sont pratiques et fiables pour évaluer rapidement les variations de communautés AsIII-oxydantes associées à différents niveaux de pollutions et de spéciation de l’As dans les eaux du bassin de l’Isle. Il est cependant difficile d’estimer précisément la richesse de cette communauté dans un écosystème à partir d’un profil DGGE puisque nous avons montré que plusieurs gènes aoxB ayant des séquences différentes sont présents chez certaines souches AsIII-oxydantes (c.f. chapitre 3). Cependant, car nous montrons dans cette étude qu’une même séquence protéique
AoxB correspond à une position de migration unique, nous pouvons conclure que la diversité des gènes aoxB déduite à partir des profils DGGE n’est pas surestimée. La spécificité des méthodes dans les eaux étudiées a été confirmée par l’obtention exclusive de gène aoxB. Malgré les biais possibles introduits par ces deux approches PCR dépendantes, ces eaux ont pu être comparées aisément entre elles car les mêmes conditions expérimentales ont été appliquées simultanément à l’ensemble des échantillons et les résultats obtenus sont reproductibles.
Des différences notables de structure des communautés bactériennes AsIII-oxydantes ont été mises en évidence selon les différents niveaux de pollution (faible, modérée ou élevée) et de spéciation de l’As dans les eaux du bassin, suggérant qu’elle soit indicatrice de la biodisponibilité de l’As dans le milieu. Les communautés dotées de gènes aoxB sont plus denses dans les eaux de surface oxiques et les quantités les plus élevées sont obtenues pour les eaux YI011 polluée par de l’AsV et YI025 polluée par de l’AsIII. Aucune corrélation claire n’a pu cependant être mise en évidence entre la spéciation de l’As et le nombre de copies de gènes aoxB. La faible concentration d’oxygène dissous dans l’eau souterraine PZR10 est probablement à l’origine de la divergence de structure de la communauté ciblée et de la faible quantité de gènes aoxB retrouvée.
Une importante diversité de gènes aoxB, affiliés à ceux des α-, β- et γ-Proteobacteria, est retrouvée dans les eaux du bassin. Des gènes aoxB similaires sont retrouvés à différents points du bassin, présentant des concentrations et spéciations similaires en As. Certaines séquences sont également proches d’OTU retrouvés dans différents compartiments environnementaux pollués par l’As à travers le monde, indiquant leur ubiquité, ainsi qu’une large répartition géographique. La présence d’une diversité et d’une quantité importante de gènes aoxB dans les eaux non polluées du bassin suggère la présence de diverses espèces AsIII-oxydantes présentant probablement des capacités physiologiques variées et susceptibles de répondre rapidement à une augmentation de la quantité d’As dans l’eau.
Cette étude apporte pour la première fois des informations sur l’abondance des gènes aoxB dans les environnements pollués par l’As et montre également que ces gènes sont présents de façon non négligeable dans les environnements non pollués par ce métalloïde. L’abondance des communautés AsIII-oxydantes et AsV-réductrices cultivables a été étudiée dans des environnements pollués ou non par l’As (Salmassi et al., 2006 ; Kuai et al., 2001 ; Jackson et
réel pour quantifier des gènes impliqués dans la biotransformation de l’As, les gènes arsC, responsable de la réduction de l’AsV (Sun et al., 2003).
Ces outils sont donc puissants pour identifier et suivre la dynamique des bactéries AsIII-oxydantes dans l’environnement et semblent prometteurs pour étudier le potentiel de bio-oxydation de l’AsIII et la réduction de la biodisponibilité de l’As dans un écosystème donné. Contrairement aux mesures physico-chimiques qui renseignent sur la qualité des eaux à un temps donné, la réponse des communautés bactériennes peut être, grâce à l’acquisition de mécanisme de tolérance, observable précocement ou au contraire après l’événement de pollution.
Un lien entre la structure des communautés AsIII-oxydantes et les concentrations d’As dans ces eaux a été mis en évidence. Ces résultats seront à confirmer à plus grande échelle en intégrant un plus grand nombre d’échantillons, situation plus contrastée en termes de concentrations en As. Une telle étude plus large est également nécessaire pour démontrer, ou non, une relation entre l’abondance des gènes aoxB et les variations des conditions environnementales.