PCR en temps réel

Le couple d’amorces m1-2F/m2-1R, ciblant les mêmes motifs qu’en DGGE, a été utilisé pour cibler les gènes aoxB dans les expériences de PCR en temps réel. Les tests d’optimisation de la PCR en temps réel ont montré que des concentrations d’amorces de 0,5 µM et une température d’hybridation de 56°C permettent d’obtenir le meilleur rapport intensité/spécificité et de limiter la formation de dimères d’amorces.

Quatre droites standard de quantification des gènes aoxB ont été crées à partir de dilutions décimales en série de quatre plasmides linéarisés contenant un fragment aoxB appartenant à des genres ou classes différentes (Figure 34). Ces fragments, amplifiés avec les amorces m1-2F/m3-2R, proviennent des échantillons environnementaux étudiés dans cette thèse, i.e. du sol industriel T12R et de l’eau YI025 (pT12RS-13, pYI025-5, pYI025-13, affilié aux β

-Proteobacteria et pYI025-20 affilié aux α-Proteobacteria). Dans les expériences de PCR en temps réel, l’amorce m2-1R se fixera donc sur le motif m2 situé au centre des fragments standards ciblés.

Une réponse linéaire est observée sur huit ordres de magnitude, de 10¹ à 10⁸ copies de gènes

aoxB, pour les dilutions des plasmides pT12RS-13 et pYI025-5 (Figure 34). Tandis qu’une

réponse linéaire est observée pour six ordres de magnitude, de 10³ à 10⁸ copies, pour les dilutions des plasmides pYI025-5 et pYI025-20. Le coefficient de corrélation (R²) est supérieur à 0,99 pour toutes les droites standards et témoigne d’une bonne reproductibilité de la technique. Des données comparables ont été rapportées pour d’autres gènes fonctionnels, tels que ceux impliqués dans la dénitrification (Henry et al., 2004) ou la réduction du nitrate (Lopez-Gutierrez et al., 2004).

Les droites de calibration réalisées à partir des dilutions de plasmides pT12RS-13 et pYI025-5 sont les plus sensibles (linéarité et donc capacité de détection jusqu’à 10 copies de gènes

aoxB) et présentent des Ct plus précoces que les deux autres pour une même quantité de gènes

initialement ajoutés.

Figure 34 : Courbe de calibration réalisée à partir de dilutions décimales des plasmides pT12RS-13, pYI025-5, pYI025-13 et pYI025-20. Les valeurs de Ct sont exprimées en fonction du log du nombre

de copies du plasmide standard.

La précision des résultats obtenus à partir de ces deux droites de calibration a été testée sur des quantités connues d’ADN génomiques de H. arsenicoxydans et T. arsenivorans (Tableau 26). La relation entre les valeurs de Ct et le logarithme du nombre de copies de gènes aoxB est linéaire. Cependant, la valeur expérimentale (nombre de copies mesurées) est en moyenne 12 fois plus faible que la valeur théorique (nombre de copies ajoutées), indiquant que la

méthode utilisée sous-estime le nombre de gènes aoxB présent sur ces génomes. Cette observation est probablement liée à la faible efficacité des amplifications PCR. En effet, la pente des droites est, en moyenne, de -4,5 (± 3,9 x 10²), indiquant une efficacité de PCR faible (68% en moyenne), mais sensiblement identique pour les 4 fragments testés.

Souches Nombre de copies aoxB

ajouté

Nombre de copies aoxB mesuré 2,9 x 10⁷ 1,4 x 10⁶ 2,9 x 10⁶ 1,6 x 10⁵ 2,9 x 10⁵ 1,1 x 10⁴ 2,9 x 10⁴ 1,5 x 10³ Herminiimonas arsenicoxydans 2,9 x 10³ 1,3 x 10² 1,7 x 10⁵ 1,7 x 10⁴ 1,7 x 10⁴ 2,5 x 10³ Thiomonas arsenivorans 1,7 x 10³ 2,6 x 10²

Tableau 26 : Nombre de copies de gènes aoxB de H. arsenicoxydans et T. arsenivorans ajoutés dans les réactions et nombre de copies mesuré par PCR en temps réel. Suite aux résultats de DGGE sur les gènes aoxB, deux copies de gènes aoxB chez T. arsenivorans ont été prises en compte dans

les calculs.

L’analyse des courbes de dissociation des produits d’amplification obtenus durant ces réactions confirme l’amplification d’un seul produit spécifique (Figure 35) pour les standards ainsi que pour H. arsenicoxydans et de deux pour T. arsenivorans. Comme attendu, les Tm de ces produits correspondent à leurs pourcentages en GC. Pour de faibles quantités d’ADN cibles (i.e. 10¹ copies de gènes aoxB), un pic secondaire est obtenu avec une Tm inférieure à 80°C, correspondant à des dimères d’amorces (Figure 35). Puisque la détection de ce faible nombre de copies intervient après 40 cycles, au-delà desquels des amplifications non spécifiques peuvent survenir, la sensibilité de détection a été limitée à 10² copies de gènes

aoxB. Enfin, les valeurs obtenues et mesurées à partir de trois réactions différentes sont du

Figure 35 : Courbes de fusions obtenues pour les produits PCR amplifiés à partir de différentes quantités d’ADN génomiques de H. arsenoxydans et T. arsenivorans.

Figure 36 : Exemple de courbe d’amplification par PCR en temps réel (A) et courbes de fusion (B) obtenues à partir d’une dilution décimale de plasmide avec le couple d’amorces

L’efficacité de ces réactions n’atteint que 68%, alors que dans la littérature, les efficacités d’amplification sur d’autres gènes atteignent en général plus de 80%. L’étape d’élongation peut être un facteur limitant de la réaction de PCR. En effet, plus le fragment est long, plus le risque d’erreur et d’arrêt de la polymérisation est élevé et donc les mesures de fluorescence biaisées. Une taille de 550 pb pour un fragment amplifié en PCR en temps réel peut donc être contraignante. Nous avons testé cette technique sur un fragment aoxB plus court amplifié avec l’amorce anti-sens m2-1R couplée à l’une ou l’autre des amorces sens (m4-1F ou m4-2F) dessinées à partir du motif FDHGGXGGGC en amont du motif m2 (c.f. alignement présenté Figure 39). Des amplifications spécifiques de 110 pb environ sont obtenues pour chacune des souches pures. Les meilleurs résultats en termes d’intensité/spécificité sont obtenus avec l’amorce m4-1F, une concentration d’amorces de 0.5 µM et une température d’hybridation égale à 57.5°C. Cependant, malgré une bonne efficacité (85,8%) avec le couple m4-1F/m2-1R, des dimères d’amorces apparaissent à partir de 10³ copies de plasmide pYI025-5 (Figure 37), et le nombre de copies mesuré est sous-estimé pour les souches H. arsenicoxydans et T.

arsenivorans (environ 10 fois plus faible).

L’ensemble de ces résultats nous a amené à choisir le couple d’amorce m1-2F/m2-1R générant un fragment de 550 pb pour les expériences suivantes de PCR en réel.

Figure 37 : Courbe de calibration (A) et courbes de fusion (B) obtenues à partir d’une dilution décimale du plasmide pYI025-5 amplifié à l’aide du couple d’amorces m4-1F/m2-1R.