Performances du biocapteur « électrostatique-extravidine-biotine »

Comme dans le cas du biocapteur « tout électrostatique » , le bon accord entre ce modèle et l’expérience (cf. …g. 8.14) indique que la réaction spéci…que de l’anti-BSA sur la BSA biotinylée coïncide avec une occupation progressive des sites disponibles jusqu’à formation d’une monocouche d’anticorps à l’interface entre la surface biofonctionnalisée et le milieu dans lequel plonge la …bre. Partant de cette hypothèse, il est possible de calculer la sensibilité (cf. eq. 8.3) du biocapteur (la pente de sa réponse) a…n de convertir les variations d’indice de réfraction mesurées en concentrations surfaciques d’anti-BSA ayant réagi sur la surface. La variation d’indice de réfraction maximale nmaxdéterminée grâce au modèle de Langmuir correspondand à la formation d’une monocouche d’anti-BSA de densité surfacique max = 1700 pg/mm2(cf. eq. 8.4), la sensibilité du biocapteur « électrostatique-extravidine-biotine »

0 20 40 60 80 100 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 concentration (g/L) conce ntration/variat ion d'indice (g/L)

Figure 8.15: Modèle de Langmuir sous sa forme linéaire. Les losanges correspondent aux points expérimen- taux et la droite en pointillés à l’isotherme de Langmuir correspondant.

s’en déduit directement :

S = nmax max

= 0; 800 10 6 u.i.r. mm2/pg (8.8)

La …gure 8.16 correspond à la conversion des valeurs de variation d’indice de réfraction mesurée en densité surfacique. Connaissant la sensibilité du biocapteur, il est désormais possible d’en déduire sa limite de détection lim correspondant à la résolution R = 10 5 du réfractomètre à réseau de Bragg à traits inclinés.

lim =

R

S = 125 pg/mm

2 _(8.9)

Il est interessant de noter que les valeurs de nmaxdéterminées grâce au modèle de Langmuir dans les con…gurations « tout électrostatique » et « électrostatique-extravidine-biotine » sont très proches (respectivement 0,00142 et 0,00136). Ce constat tend à prouver que la densité de sites de reconnaissance disponibles pour l’anti-BSA est la même dans les deux cas, ce qui se traduit par des valeurs de sensibilité et de limite de détection équivalentes. L’utilisation d’extravidine et de BSA biotinylée n’a donc pas d’e¤et sur la sensibilité du capteur.

En revanche, la constante d’a¢ nité K, représentative de l’activité biologique des protéines immobilisées en surface de la gaine optique, passe de 13; 5 L/g dans la con…guration « tout électrostatique » à 61; 5 L/g pour le biocapteur « électrostatique-extravidine-biotine » . Cette progression indique que la protéine sonde (BSA) subit moins de dénaturations lorsqu’elle est …xée par l’intermédiaire du fragment biotine que par simples interactions électrostatiques. La concentration limite d’anti-BSA présente en solution Clim étant inversement proportionnelle à la constante d’a¢ nité K (cf. eq. 8.7), cette activité accrue des sondes adsorbées se traduit par une augmentation de la reconnaissance anticorps-antigène à faible concentration.

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 concentration d'anti-BSA (g/L) concent ration su rfaciqu e (pg/mm ²)

Figure 8.16: Concentration surfacique d’anticorps ayant réagi pour di¤érentes concentrations d’anti-BSA en solution. Les losanges correspondent aux points expérimentaux et la courbe à l’isotherme de Langmuir correspondant.

Clim= 120 g/L (8.10)

Finalement, pour des concentrations surfaciques limites lim équivalentes, le biocapteur « électrostatique-extravidine-biotine » est donc potentiellement capable de détecter la bio- molécule cible (l’anti-BSA) présente en solution à des concentrations quatre fois inférieures à ce qui est réalisable dans la con…guration « tout électrostatique » . L’introduction de l’extravidine constitue donc une amélioration majeure apportée au protocole de biofonction- nalisation reposant sur l’exploitation des interactions electrostatiques.

Biocapteur issu d’une

fonctionnalisation du substrat de

silice faisant intervenir des liaisons

covalentes

Les premiers biocapteurs réalisés aux cours de ces travaux reposent sur une fonctionnalisation du substrat de silice basée sur l’exploitation des interactions électrostatiques qui existent entre une surface et des molécules en solution de charges opposées. Ces méthodes sont relativement simples et rapides à mettre en œuvre. De plus, elles autorisent la régénération rapide et complète du substrat de silice. Une même …bre à réseau de Bragg en angle peut être réutilisée un très grand nombre de fois, par simple nettoyage de la surface de silice à la soude à 1 mol/L. Néanmoins, cette facilité de décapage révèle également la « fragilité » des bio…lms obtenus par ce type de protocoles de biofonctionnalisation. A…n d’accroître la stabilité des bio…lms conçus pour réagir de façon spéci…que avec une biomolécule cible, la multicouche de polyélectrolytes peut être remplacée par un polymère gre¤é sur la surface de la …bre optique par l’intermédiaire de liaisons covalentes.

9.1

Fonctionnalisation covalente du substrat de silice

La stratégie choisie pour la fonctionnalisation du substrat par liaisons covalentes repose sur la croissance in situ d’un polymère à partir de la surface : cette méthode porte le nom de polymérisation grafting from. Un grand nombre de protocoles grafting from sont décrits dans la littérature et proposent de réaliser la polymérisation en milieu organique. Or, l’indice de réfraction de ces milieux est trop élevé (s 1,45) pour le suivi en temps réel de la réaction de polymérisation par réfractométrie à réseau de Bragg en angle. Aussi l’une des premières di¢ cultés rencontrées lors de la mise en œuvre de ces méthodes se situe-elle au niveau du contrôle de la longueur des chaînes polymères. Si ces dernières sont trop courtes, les polymères

ne jouent pas leur rôle d’espaceur qui isole les protéines de la surface du substrat de silice. Les molécules biologiques risquent alors d’être dénaturées et de perdre une partie voire la totalité de leur activité biologique. Inversement, si les chaînes polymères sont trop longues, le réfractomètre à réseau de Bragg en angle est saturé car l’indice de réfraction moyen autour de la …bre est devenu trop élevé. Dans ce cas, le capteur devient « aveugle » .

Les premières tentatives de fonctionnalisation covalente selon un protocole grafting from en milieu organique ont montré la faisabilité d’une croissance in situ de chaînes polymères. Cependant, l’impossibilité du contrôle de l’épaisseur de la couche de fonctionnalisation posait problème. Par la suite, un second protocole de polymérisation grafting from a été mis au point, de manière à ce que « l’étape clé » de polymérisation in situ puisse être réalisée en milieu aqueux. Ainsi, la croissance de la couche de polymères peut être contrôlée en temps réel et stoppée dès lors que son épaisseur atteint une valeur permettant d’optimiser les performances du futur biocapteur.