Le fonctionnement des biocapteurs nécessite l’utilisation d’un biorécepteur dont dépend le signal biologique émis. Au moins trois types de molécules biospéci…ques peuvent jouer le
rôle de biorécepteur. Les immunoespèces (anticorps, antigène), les enzymes et les acides nu- cléiques (ADN, ARN) servent à concevoir respectivement des capteurs immunologiques, des capteurs enzymatiques, et des biopuces. Le principe de détection du capteur immunologique repose sur les modi…cations physico-chimiques de la couche sensible, induites par la forma- tion des complexes immuns. Dans le cas du capteur enzymatique, la mesure s’e¤ectue par l’intermédiaire de la détection d’un produit de la réaction chimique catalysée par l’enzyme. En…n, le fonctionnement des biopuces repose sur des phénomènes d’hybridation.
Il est également possible de concevoir des biocapteurs à base de cellules entières. La détection consiste alors à suivre certains signaux représentatifs de leur métabolisme.
3.2.1 Les anticorps
Les anticorps sont couramment utilisés pour la conception de biocapteurs car ces protéines possèdent des sites capables de reconnaître spéci…quement une substance cible, qui constitue l’antigène correspondant.
Les anticorps sont formés de quatre chaînes polypeptidiques, dont deux lourdes et deux légères. Elles sont reliées entre elles par un nombre variable de ponts disulfures assurant une ‡exibilité de la molécule. Ces chaînes forment une structure en Y. Pour un anticorps donné, les deux chaînes lourdes sont identiques, de même pour les deux chaînes légères. Chaque chaîne polypeptidique est formée d’une partie constante et d’une partie variable. Les parties constantes sont caractérisées par une séquence en acides aminés très proche d’un anticorps à l’autre. Ils ne sont pas impliqués dans la reconnaissance de l’antigène. Les parties variables sont situées aux extrémités des deux « bras » . L’association entre un domaine variable porté par une chaîne lourde et le domaine variable adjacent porté par une chaîne légère constitue le site de reconnaissance de l’antigène. Ainsi, un anticorps possède deux sites de liaison à l’antigène, un au bout de chaque bras (cf. …g. 3.1). Ces deux sites sont identiques, d’où la possibilité de lier deux molécules d’antigène par anticorps [Janeway 2003].
La détection de l’interaction anticorps-antigène peut être basée sur des méthodes dites de marquage. En e¤et, de nombreux travaux ont eu recours au marquage de l’anticorps ou de l’antigène par une enzyme ou un ‡uorochrome qui permet de suivre facilement la réaction de reconnaissance moléculaire. Cependant, ce sont les méthodes de détection immunologique directe, c’est-à-dire n’utilisant pas de molécules marquées, qui suscitent aujourd’hui un intérêt croissant. La mise au point de ces méthodes suppose qu’un signal physique induit par la formation du complexe immun (ou complexe antigène-anticorps) puisse être mesuré. À ce jour, les modes de détection optique, piézoélectrique et électrochimique ont déjà été envisagés.
3.2.2 Les enzymes
Une enzyme est un catalyseur biologique, une protéine permettant d’accélérer jusqu’à dix millions de fois les réactions chimiques se déroulant aussi bien à l’intérieur qu’à l’extérieur de
Sites de reconnaissance de l’antigène Ponts disulfures Chaîne lourde Chaîne légère partie variable partie constante
Figure 3.1: Schéma de la structure d’un anticorps
la cellule [Splittgerber 1985]. Elles agissent à faible concentration et se retrouvent intactes en …n de réaction.
La fonction des enzymes est liée à la présence dans leur structure d’un site actif dans lequel peut venir se …xer le substrat de forme complémentaire. Une fois …xé, le substrat va réagir pour donner le produit. Le site actif est donc une zone particulièrement importante de la protéine puisqu’elle assure la …xation du substrat (site de …xation) et sa transformation (zone du site de …xation correspondant au site de catalyse). Les enzymes présentent ainsi une grande spéci…cité par rapport aux substrats et vis-à-vis des réactions qu’elles catalysent. La spéci…cité de la réaction que catalyse chaque enzyme en fait un biorécepteur adapté à la conception de biocapteurs sélectifs. Ainsi, de nombreux travaux portent sur la mise au point de biocapteurs permettant le suivi de l’activité enzymatique [Dzyadevych 2003]. Le suivi des réactions enzymatiques est généralement assuré par l’intermédiaire des quantités de produits formés ou de réactifs disparus. Cependant, de nombreux facteurs, tels que les concentrations en enzyme et en substrat ou les caractéristiques physico-chimiques du milieu (température, pH, etc.) peuvent venir perturber les réactions enzymatiques et doivent être ajustés pour optimiser les performances des biocapteurs enzymatiques.
3.2.3 L’ADN
L’ADN (acide désoxyribonucléique) renferme les informations nécessaires à la synthèse des protéines. Les séquences formées à partir des quatre molécules de base de l’ADN, appe- lées nucléotides (adénine, guanine, cytosine, thymine), constituent un message codé portant l’information génétique. Chaque molécule d’ADN est composée de deux brins complémen- taires se faisant face et formant une double hélice [Watson 1953], les nucléotides ayant la
particularité de s’apparier sélectivement deux à deux. La succession de nucléotides trouvée dans un brin possède une unique succession de nucléotides complémentaires avec laquelle il peut interagir.
Le principe de la puce à ADN repose sur la sélectivité de l’interaction entre deux chaînes de nucléotides et la capacité d’un brin d’ADN à reformer spontanément la double hélice face au brin complémentaire. Le champ d’application de cette technique s’étend à un grand nombre de problèmes biologiques tels que le séquençage du génome humain [Brown 1999], l’étude de l’expression d’un gène ou la recherche des mutations ponctuelles responsables de certaines maladies génétiques comme la mucoviscidose [Mannelli 2006].
Il est aujourd’hui possible de …xer sur une même plaque plusieurs dizaines de milliers de fragments de brins d’ADN complémentaires des chaînes à détecter.
3.2.4 Les cellules entières
Les cellules entières possèdent de nombreuses enzymes membranaires. Il est possible de suivre certains signaux représentatifs du fonctionnement de ces enzymes ainsi que leur perturbation après une exposition à un toxique.
Les cultures de cellules sont souvent simples à mettre en œuvre. Ainsi, leur utilisation directe permet de s’a¤ranchir des étapes d’extractions ou de puri…cations nécessaires dans le cas de biocapteurs à enzymes pures. En…n, étant donné qu’elles sont sollicitées dans leur environnement naturel, les enzymes membranaires (présentes sur les membranes cellulaires) sont plus stables et moins sensibles aux variations des caractéristiques physico-chimiques du milieu que les enzymes pures [D’Souza 2001].
A…n d’étendre le domaine d’application de ce type de biorécepteur, il est possible d’utiliser des cellules génétiquement modi…ées. Généralement, un gène marqueur (ou rapporteur), codant pour un produit rapidement visualisable et précisément quanti…able, est fusionné avec une séquence de nucléotides appelée promoteur, qui régule l’expression du gène associé.
Certains promoteurs ont la particularité d’être impliqués dans les réponses cellulaires à cer- tains changements du milieu environnant. Par exemple, en associant le gène marqueur lacZ codant pour l’enzyme -galactosidase à des promoteurs zntA répondant à la présence de mé- taux lourds, le signal de ‡uorescence émis par les cellules est directement proportionnel à la concentration du milieu en métaux lourds [Biran 2003].