Cinétique d’adsorption de la biomolécule sonde

Les variations d’indice mesurées en temps réel lors de la phase d’adsorption de la BSA per- mettent d’observer la cinétique d’accrochage de la protéine sur la multicouche de polyélec- trolytes. Au bout d’un certain temps, le signal atteint un plateau qui indique que l’équilibre entre la surface et la solution a été atteint. Nous avons ainsi estimé à 30 minutes le temps d’incubation nécessaire pour atteindre cet équilibre avec une solution de BSA à 10 g/L dans le PBS. Cependant, tout ceci n’est vrai que dans le cas d’une agitation en continu. En e¤et,

bras de levier laser photodiodes échantillon asservissement de position pointe AFM Z Y X positions pilotage de l a platine

Figure 7.11: Schéma de principe décrivant le fonctionnement de la microscopie à force atomique.

(b) (a)

Figure 7.12: Images AFM de 1 m2des surfaces (a) d’une …bre fonctionnalisée par une multicouche de poly- électrolytes se terminant par une couche de PEI (échelle en hauteur de 10 nm) et (b) d’une …bre fonctionnalisée de la même façon et biofonctionnalisée ensuite avec la BSA (échelle en hauteur de 20 nm).

sans agitation, l’adsorption de BSA en surface de la …bre provoque une diminution locale de la concentration en BSA au voisinage de cette surface. Il en résulte alors une moins bonne adsorption des protéines. La …gure 7.13 illustre bien ce phénomène : dans le cas ou le réseau est plongé dans une solution de BSA à 10 g/L agitée en permanence, le palier est obtenu au bout de 30 minutes et la variation d’indice est de 0,00327. Par contre, sans agitation, le palier n’est toujours pas atteint au bout de 30 minutes et la variation d’indice, fortement ralentie, est plus faible. La quantité de BSA …xée est donc moins importante. En revanche, si l’agitation est remise en route, les gradients de concentration sont détruits et la BSA recom- mence à se …xer sur la surface, jusqu’à atteindre la valeur obtenue dans le cas d’une agitation permanente. 0,000 0,001 0,002 0,003 0,004 0 10 20 30 40 50 temps (min)

variation d'indice BSA 10 mg/mL,_{agitation permanente} BSA 10 mg/mL, agitation à t = 15 min

début d'agitation

Figure 7.13: Cinétiques d’adsorption de la BSA mettant en évidence l’importance de l’agitation.

Finalement, les premiers essais de biofonctionnalisation reposant sur l’exploitation des inter- actions électrostatiques ont permis de :

(i) démontrer la capacité d’un réfractomètre reposant sur la technologie des réseaux de Bragg à traits inclinés à suivre en temps réel les étapes successives d’accrochage en surface de polyélectrolytes,

(ii) déterminer le nombre de couches et les temps de dépôt correspondant à une optimisation des performances du futur capteur,

(iii) démontré la capacité d’un réfractomètre à détecter l’accrochage d’une protéine comme la BSA.

Ces résultats ont été obtenus dans le cadre de concentrations relativement élevées. Cependant, les fortes variations observées sur la réponse du capteur ont permis d’envisager la détection d’anticorps à de plus faibles concentrations. Cette étude fait l’objet du chapitre suivant qui propose également une amélioration du protocole de biofonctionnalisation fondée sur la médiation d’une protéine de liaison : l’extravidine.

Performances et limites du

biocapteur « tout

électrostatique » : introduction de

l’extravidine

Le lecteur l’aura compris, les travaux présentés visent à concevoir un Capteur à Fibres Op- tiques biosélectif fondé sur la technologie des réseaux de Bragg à traits inclinés, composants « tout …bre » sensibles aux variations d’indice de réfraction du milieu environnant. Ce type de réfractomètre devient potentiellement sensible vis-à-vis d’une unique molécule cible dès lors que la surface du substrat de silice que constitue la …bre optique est biofonctionnalisée, ce qui consiste à gre¤er, en surface du capteur, un bio…lm conçu pour réagir de manière sélective. L’accrochage de la molécule cible sur le bio…lm se traduit alors par des variations d’épaisseur et/ou d’indice du …lm qui se répercutent sur la réponse spectrale en transmission du réseau. La partie sensible d’un tel réfractomètre intègre donc deux fonctions transduc- trices complémentaires : d’une part le bio…lm sélectif permettant la détection de la molécule cible en codant l’évènement sous forme d’une variation physique de la couche sensible, et d’autre part le réseau à traits inclinés transformant cette variation d’épaisseur / indice de réfraction « moyen » en une modi…cation du spectre qu’il transmet.

Dans le cas du biocapteur « tout électrostatique » , la construction du bio…lm sélectif repose sur la formation d’une multicouche de polyélectrolytes et l’adsorption d’une protéine sonde par interactions électrostatiques. Les premiers résultats obtenus avec de la BSA, récepteur spéci…que de l’anti-BSA, ont permis de valider le principe d’une détection de la …xation de biomolécules cibles en surface d’une …bre optique contenant un réseau de Bragg à traits in- clinés. Cependant, précisons qu’il s’agissait à cette étape de l’étude, de prouver la faisabilité d’une biofonctionnalisation et rien de plus, dans la mesure où le couple BSA / anti-BSA ne présente pas d’intérêt particulier d’un point de vue applicatif. Aussi avons-nous également essayé de réaliser le même type d’expériences avec la -lactoglobuline (BLG), protéine aller- gisante du lait de vache et récepteur spéci…que de l’anti- -lactoglobuline, protéine produite

par les sujets qui y sont allergiques1_{. Dans ce cas, la protéine présente un intérêt d’un point} de vue immunologique, mais nos di¤érentes tentatives ont montré que si la …xation de la pro- téine sur la multicouche de polyélectrolytes par interactions électrostatiques avait bien lieu, elle n’était en revanche pas stable à long terme. Ainsi, a…n de s’a¤ranchir de la spéci…cité en termes de protéine, il a été nécessaire d’envisager une technique de biofonctionnalisation plus stable, à savoir l’utilisation de l’a¢ nité avidine-biotine.

8.1

Performances du biocapteur « tout électrostatique »

A…n de réaliser un biocapteur « tout électrostatique » de sensibilité optimale sur une large plage de mesures, quatre bicouches PEI/DSS ont été déposées. Une dernière couche de PEI sert à l’adsorption de la BSA, récepteur spéci…que de l’anti-BSA (anticorps correspondant), chargée négativement à pH 7,4. À ce stade, dix couches ont été déposées en surface de la …bre, ce qui permet ensuite d’observer la …xation spéci…que de la protéine à détecter (l’anti-BSA).