Une séquence isolée est équivalente à 75% de la protéine NonO (Pour revue : Shav-Tal
et Zipori, 2002). Historiquement, elle est impliquée dans l’épissage des ARN. Par la
suite, il s’est avéré qu’elle est également une des unités d’un complexe répresseur
comprenant une protéine apparentée PSF, mSin3 et une histone-désacétylase (Sewer et
al., 2002). Emili et ses collaborateurs ont proposé que NonO, dénommé aussi P54nrb,
soit responsable de l’initiation et de l’élongation de la transcription suite à la découverte
de leur interaction avec le domaine C-terminal de l’ARN pol II (Emili et al., 2002). Les
candidats isolés possèdent un des deux domaines RRM (nécessaire pour la liaison avec
l’ARN), le domaine hélice-tour-hélice (HTH), un domaine acide/basique et une région
riche en prolines.
ETR-1, (Elav type RNA binding protein) protéine à motif de liaison à l’ARN (Knecht et
al., 1995), dont la séquence obtenue représentait 76% de la protéine entière. Sa seule
fonction connue pour le moment est l’épissage d’ARN. Son expression est
principalement liée au système neural bien qu’elle soit aussi essentielle pour le
Résultats et Discussion
développement musculaire (Milne et Hodgkin, 1999). Chez le xénope, au stade 13, elle
est exprimée au niveau de la plaque neurale (Knecht et al., 1995). Il est à remarquer que
ETR-1 est induit par la voie Notch comme HRT1 (Akanuma et al., 2002).
La séquence codante entière d’une protéine de xénope, similaire à BLOM7-β, a été
isolée. Il s’agit d’une protéine humaine prédite qui posséderait un domaine de liaison à
l’ARN de type KH. Elle a été découverte récemment et très peu de renseignements la
concernant sont disponibles.
Riddle 3 est une protéine de xénope sans domaine ni fonction connus. La proie isolée
contenait 91% de la protéine complète. La protéine Riddle3 n’a pas encore fait l’objet de
publication et l’utilisation d’outils bioinformatiques ne nous a pas permis de mettre en
évidence l’existence de domaine connu au sein de la protéine.
Deux clones correspondant à la protéine HLA-B du MHC de classe 3 ne contenaient
qu’une séquence partielle (20%).
Une séquence similaire à une golgine de rat (pour revue : Barr et Short, 2003) ne
correspondait qu’à 25 % de la séquence codante complète.
La séquence isolée LOXL1 codant une protéine avec un domaine lysyl oxydase (Molnar
et al., 2003) ne correspondait qu’à 78% de la protéine entière.
La séquence GPS2 isolée lors de notre criblage code la protéine entière. Historiquement,
GPS2 a été découverte par sa capacité à supprimer des mutations létales des sous-unités
régulatrices des protéines G dans la voie de réponse aux phéromones chez la levure
(Spain et al., 1996). Plusieurs articles présentent GPS2 comme régulateur de la
transcription (Jin et al., 1997; Peng et al., 2001). Récemment, il s’est avéré que GPS2
appartiendrait au complexe répresseur N-CoR-HDAC3 (Zhang et al., 2002). Cette proie
sera étudiée plus loin (voir point II.D.1.).
Résultats et Discussion
Amino Enhancer of Split (AES) a été représentée par un clone correspondant à une
séquence protéique quasi entière (82%). AES ou grg5 appartient à la famille
Groucho-TLE (Fisher et Caudy, 1998b). Cette protéine contient uniquement les domaines Q et GP
impliqués dans l’oligomérisation et l’activité répressionelle (Chen et Courey, 2000). Elle
ne possède pas le domaine S/P impliqué dans l’interaction de Groucho avec le
tétrapeptide WRPW des H & E(Spl) (Dawson et al., 1995; Fisher et al., 1996; Li, 2000).
Elle a été décrite comme co-répresseur (Tetsuka et al., 2000; Brinkmeier et al., 2003)
mais également comme co-activateur de Runx2 (Zamurovic et al., 2004). Etant donné
que les protéines de la famille HRT interagissent faiblement avec Groucho (Fischer et al.,
2002; Pichon et al., 2004), AES semble être un partenaire potentiel intéressant. Cette
proie sera étudiée plus loin (voir II.D.2.).
Les protéines HLA-B, LOXL et Golgine n’étant pas reliées de près ou de loin à
l’activité transcriptionnelle et les séquences isolées étant tronquées (HLA-B/golgine), nous
supposons que ces protéines seraient de faux positifs. Bien que les autres proies soient des
candidates potentiellement intéressantes, nous avons ciblé notre travail sur GPS2 et AES. Ces
protéines se présentaient comme les plus prometteuses. En effet, elles ont ont été isolées sous
des forme complètes ou presque et sont décrites comme participant au contrôle de la
transcription. L’analyse de ces proies est détaillée au chapitre II.D..
His Ade XHRT1 TOT 1-294 XHairy 1 TOT 1-263 XHairy 2b TOT 1-277 C -Proie XHRT1 TOT 1-294 XHairy 1 TOT 1-263 XHairy 2b TOT 1-277 C
-Figure 32 : Analyse des interactions XHairy2b-XHRT1 et XHairy1-XHRT1en double-hybride de levure.
Les diploïdes obtenus par conjugaison des clones exprimant respectivement les différentes protéines de fusion Gal4 DBD (appât) et AD (proie) sont testés sur milieu carencé en histidine contenant 1mM de 3-AT (His) ou en adénine (Ade). Le temps de croissance est respectivement de 7 et 3 jours.
Les protéines appâts testées sont le XHairy2b complet (XHairy2b TOT), le XHRT1 complet (XHRT1 TOT) et ses formes tronquées : le domaine bHLH, les domaines bHLH-Orange (bHLH-O), la partie IYT, la protéine délétée du domaine bHLH (∆ HLH) et de son domaine Orange (∆ O). En proie, les XHRT1, XHairy1 et XHairy2b complets (XHRT1, XHairy1 et XHairy2b TOT) ont été utilisés. Les fragments de la protéine XHRT1 contenus dans chaque protéine appât sont renseignés par leurs coordonées en acides aminés au sein de de la protéine complète. Le contrôle positif appât est la partie N-terminale du PIE8 (NT-PIE). Les contrôles négatifs (C -) sont le Gal4 DBD et le Gal4 AD seuls pour les appâts et les proies respectivement.
Au dessous de la figure se trouve le schéma de la structure de XHRT1 avec la position des résidus délimitant les différents domaines ou motifs de la protéine. Les domaines et les motifs sont représentés en couleur : en bleu pour le domaine obasique (b); en rouge pour le domaine hélice-boucle-hélice (HLH): en orange, le domaine Orange (O); en bleu clair la région intermédiaire (I); en jaune le motif YRPW et en vert le motif TEIGAF.
XHRT1 NT-PIE C -Appât XHairy2b ∆HLH TOT 1-294 ∆58-95 ∆O 1-294 ∆116-159 bHLH 1-114 bHLH-O 36-170 IYT 160-294 TOT 1-277 1-294
TEIGAF
TEIGAF
YRPW
YRPW
HLH
HLH OO
b
b II
117 117 100 100 58 58 45 45 159159 284284289289294294XHRT1
Résultats et Discussion
II.B. Protéine de type bHLH-O.
Comme nous nous attendions à l’isolement de protéines de type bHLH capables de
s’hétérodimériser avec XHRT1 lors du premier criblage, il était intéressant d’analyser plus en
détails ces partenaires. Cette partie du travail comprend l’analyse des interactions XHRT1
avec XHairy2b, XHairy1 et lui-même.
II.B.1. Interaction XHairy1 / XHairy 2b avec XHRT1.
Nous avons caractérisé les domaines de XHRT1 impliqués dans ses interactions avec les
deux facteurs XHairy1 et XHairy2b.
Une série de mutants présentant des délétions au sein de la protéine XHRT1 a été réalisée en
introduisant dans le vecteur pPC97 des séquences codant respectivement pour le XHRT1
complet, la protéine délétée de son domaine HLH (∆ HLH) ou du domaine Orange (∆O), le
domaine bHLH, les domaines bHLH et Orange, et la partie située en C-terminale du domaine
Orange (IYT). La séquence codant XHairy2b a été intégrée dans le vecteur appât (pPC97),
afin de vérifier si l’interaction est également possible lorsque XHRT1 est utilisé comme proie.
Nous avons transformé la souche de levure PJ69-4A à l’aide de ces plasmides recombinants.
La séquence codant le XHRT1 complet a été introduite dans le vecteur pPC86. La souche de
levure PJ69-4α a été transformée par les différentes constructions proies.
Les souches de levure exprimant la protéine appât XHairy2b ainsi que les différentes
chimères appâts de XHRT1 ont été conjuguées avec les souches exprimant XHRT1, XHairy1
et XHairy2b complets en proies. Les diploïdes obtenus, à l’issue de la sélection sur milieu
carencé en leucine et tryptophane, ont été testés sur milieu carencé en histidine
avec 1 mM de 3-AT (7 jours de croissance) ou sur milieu carencé en adénine (3 jours de
croissance) (Figure 32).
Pour le couple XHRT1-XHairy1, les levures dont la protéine appât possède le domaine bHLH
de XHRT1 couplé soit à son domaine Orange soit à sa partie intermédiaire, pouvent croître
sur le milieu de sélection histidine ou adénine. Dans le cas où la chimère appât comprend
XHRT1 délété de son domaine HLH, la souche de levure qui l’exprime ne survivait que sur le
IYT bHLH 28S 18S -A XHRT1 bHLH -IYT bHLH XHRT1 - IYT B Appât XHRT1 Proie C C 28S 18S -C D
Figure 33 : Expression des ARNm des appâts XHRT1 bHLH et de la proie contrôle négatif (Gal4 AD seul, C -). (A-C) Vérification de la qualité des ARN testés par visualisation des ARN après coloration à l’acridine orange
du gel d’électrophorèse.
(B-D) Analyse par transfert de type Northern. Les sondes utilisées sont les séquences de Gal4 codant respectivement le domaine de liaison à l’ADN pour les appâts et le domaine d’activation pour la proie.
Myc XHRT1
WB: a-Flag
WB: a-Myc
Figure 34 : Analyse par co-immunoprécipitation de l’homodimérisation de XHRT1 et son hétérodimérisation avec Xhairy1 et Xhairy2b.
Les protéines étiquetées sont surexprimées en embryons de xénope. Les extraits protéiques bruts et les protéines immunoprécipitées à l’aide d’anticorps anti-Myc (IP: a-Myc) sont analysés par immunodétection avec des anticorps anti-Myc (WB: a-Myc) ou anti-Flag (WB: a-Flag).
L réprésente la position des chaînes légères des anticorps anti-Myc.
XHRT1 est étiqueté au Flag et au Myc. XHairy1, XHairy2b, ESR9, ESR10 et HES6r sont étiquetés au Myc. Les trois protéines ESR9, ESR10 et HES6r sont utilisées comme contrôles négatifs.
(voir aussi l’article 2 en annexe)
L
-WD: a-Flag
Extraits bruts
IP: a-Myc
Flag
XHRT1
HES6r
ESR10
ESR9
XHairy2b
XHairy1
L
-B
A
Figure 35 : Mise en évidence des régions de XHRT1 impliquées dans les interactions XHRT1-XHairy1 et XHRT1-XHairy2b.
(A) Représentation schématique des protéines chimériques réalisées entre XHRT1 et ESR9.
(B) Analyse par co-immunoprécipitation des régions de XHRT1 impliquées dans les interactions XHRT1-XHairy1 et XHRT1-XHairy2b.
Les protéines étiquetées au Myc sont les chimères XHRT1/ESR9 et les protéines étiquetées au Flag sont les Xhairy1 et Xhairy2b complets. Ces protéines sont surexprimées en embryons de xénope. Les extraits protéiques bruts (Lysate) et les protéines immunoprecipitées à l’aide d’anticorps anti-Myc (IP:α-Myc) sont analysés par immunodétection avec des anticorps anti-Myc (WB: α- Myc) ou anti-Flag (WB:α-Flag).