Conclusions et perspectives

La transcription est un des mécanismes fondamentaux régulant la vie de la cellule. Elle

est à la base de l’expression du génome. Des ARN spécifiques sont produits en réponse à des

stimuli internes ou externes, et ceci implique l’activation de certains facteurs de transcriptions

spécifiques. Ces derniers sont importants pour toute une série de différenciations cellulaires

comme la somitogenèse ou la myogenèse. Identifier les protéines impliquées dans un de ces

processus précis permet une compréhension plus approfondie de ces phénomènes.

Au début de notre travail, un de ces facteurs venait d’être isolé dans notre laboratoire et

présentait des similitudes avec les Hairy and Enhancer of Split responsables de l’inhibition

latérale conduisant à la formation des neurones. Cette protéine, bc8 ou HRT1, fut à la base de

ce projet. Nous nous sommes proposés de rechercher ses partenaires protéiques par la

technique du double-hybride afin de mieux comprendre son mécanisme d’action moléculaire

dans la neurogenèse. L’organisme modèle utilisé à la base est le xénope qui, par ses embryons

de grande taille et son développement ex utero, permet une manipulation aisée ainsi que des

études d’expression de gènes in vivo. Au début de ce projet, seul le facteur bHLH-PAS ARNT

était connu comme partenaire de HRT1 (Chin et al., 2000).

A la fin de ce travail, d’autres groupes ont découvert différents partenaires de HRT1.

dHAND et eHAND sont impliqués dans le développement cardiovasculaire (Firulli et al.,

2000). MyoD est connu pour sa fonction myogénique (Sun et al., 2001a). Hairy1 de poulet

(CHairy1) serait important pour la somitogenèse (Leimeister et al., 2000). HRT2 est capable

de dimériser avec HRT1 (Leimeister et al., 2000). Runx2 joue un rôle dans la différenciation

ostéoblastique (Zamurovic et al., 2004).

Nous avons identifié plusieurs protéines à partir de différents domaines de ce facteur. Les

domaines bHLH-Orange de XHRT1 nous ont révélé trois partenaires : Xhairy1, XHairy2b et

BOIP. A cet interactome, nous avons donc apporté les partenaires précités ; de plus nous

avons confirmé l’homodimérisation de XHRT1. La Figure 63 reprend les différents

partenaires connus de HRT1 en fonction du rôle supposé ou connu du dimère formé.

Conclusions et Perspectives

Point de départ de ce travail, la technique du double-hybride est un outil généralement

utilisé pour la recherche d’interaction binaire entre protéines. Depuis son invention, il y a

quinze ans (Fields et Song, 1989), le système n’a cessé d’être amélioré pour pallier certains de

ses défauts intrinsèques. Le principe à la base du système est l’utilisation de protéines de

fusion à activité complémentaire. Bien qu’il soit communément admis que les domaines

d’une même protéine soient des entités séparalables, le résultat apporté par la fusion de deux

domaines issus de protéines différentes ne peut être prédit. Certaines protéines recombinantes

peuvent exposer à la suface des domaines normalement situés dans la structure interne ou

masquer des domaines exposés dans la structure naturelle induisant ainsi des résultats

faussement positifs ou négatifs.

Dans notre cas, les faux négatifs sont les différents partenaires de HRT1 exprimés au stade

neurula chez le xénope et qui n’ont pas été isolés lors des criblages (ARNT, HAND, MyoD,

HRT2, Runx2). Les faux positifs seraient les protéines dont l’interaction n’a pu être

confirmée par une technique indépendante (GPS2 et AES) ou les protéines qui ne sont pas

connues pour être impliquées dans l’activité de HRT1 ni co-localisées avec lui de manière

spatio-temporelle (LIP1-α, LOXL1,…). Plusieurs études de l’interactome de S. cerevisiae,

par différents criblages, ont été réalisées dernièrement (Ito et al., 2000; Uetz et al., 2000; Ito et

al., 2001). De ces études et de leur analyse (Matthews et al., 2001; Ito et al., 2002; Sprinzak et

al., 2003), il ressort que 90 % des interactions découvertes par un groupe de chercheurs ne

l’étaient pas dans un autre. En effet, les deux études ont abouti à l’identification de 692 et 841

interactions significatives (isolées plus de trois fois) respectivement pour le groupe d’Uetz et

celui de Ito. En comparant toutes les interactions, seulement 141 se recouvrent. De plus, il

s’est avéré que 90 % des interactions connues n’ont pas été recensées. Et en se basant sur la

co-localisation cellulaire et le rôle des partenaires, il fut estimé que 50 % des interactions

n’avaient pas de sens évident d’un point de vue physiologique. Par conséquent, il n’est pas

étonnant que nous n’ayons pas obtenu ici les mêmes partenaires que les autres groupes de

chercheurs travaillant sur les HRT.

Il ne faut pas oublier que la levure n’est pas une cellule eucaryote supérieure. Ce qui implique

que certaines modifications post-traductionnelles n’existent pas ou sont différentes

chez S. cerevisiae et peuvent aussi éventuellement entraîner des cas de faux positifs ou de

faux négatifs.

L’étude d’interaction protéique par des techniques génétiques comme le double-hybride a ses

avantages et ses inconvénients. Il en va de même avec les techniques de protéomique.

Conclusions et Perspectives

L’immunoprécipitation de protéines endogènes ou étiquetées suivie d’un séquençage par

spectrométrie de masse est une des techniques de protéomique de plus en plus utilisée. Elle

permet d’analyser des interactions protéiques supérieures à deux composants en une seule

expérience. Deux études ont été réalisées sur le protéome de la levure (Gavin et al., 2002; Ho

et al., 2002). Ces deux analyses testèrent respectivement 1739 et 725 gènes. Ce qui est loin du

protéome complet qui peut être obtenu lors de criblages double-hybrides. Seulement 10% des

complexes et interactions obtenus sont identiques dans les deux analyses (Ito et al., 2002).

Les données recueillies au cours de ce projet suggèrent que malgré ces imperfections, le

double-hybride reste un outil performant, facile et peu onéreux dans la recherche

d’interactions binaires. Il faut tout de même garder à l’esprit qu’il substiste le problème

majeur de distinguer les vrais positifs des faux. Néanmoins, utiliser le double-hybride en

levure en combinaison avec des méthodes plus axées sur la recherche de complexes

protéiques permettrait un apport d’informations supplémentaires.

La transcription requiert la formation de complexes composés en général de bien plus de deux

entités. En effet, la régulation implique un ensemble de protéines facteurs de transcription /

co-facteurs / enzymes de modifications ou de remodelage d’histones. Afin d’avoir une idée

plus précise du multimère contenant HRT1, il serait intéressant d’utiliser le TAP (Tandem

Affinity Purification, autrement dit la purification d’affinité en tandem).

Après ces considérations techniques, passons aux trois partenaires de XHRT1, Xhairy

1, XHairy2b et BOIP, que nous avons étudié au cours de ce travail.

Nous avons déterminé une spécificité d’interaction avec XHRT1 différente pour les

deux facteurs de type bHLH-O, XHairy1 et XHairy2b. Nous avons montré en double-hybride

que XHairy2b interagissait par l’intermédiaire des domaines bHLH-O tandis que l’interaction

XHairy1 semble être liée en partie au domaine Orange et au domaine intermédiaire. Cette

spécificité entre les domaines intermédiaires de deux protéines de type bHLH-O n’avait pas

encore été décrite dans la littérature. Pour confirmer l’importance de la partie C-terminale, des

études de mutagenèse pourraient être entreprises afin de mieux délimiter les acides aminés

intervenant dans l’interaction. Utiliser également le domaine IYT en proie lors de tests

double-hybrides pourrait confirmer l’interaction de ce domaine avec XHairy1. Idéalement,

nous pourrions purifier les deux dimères XHRT1-XHairy2b / XHRT1-XHairy1 et analyser

leur structure tridimensionnelle par diffraction aux rayons X ou par d’autres techniques

spectroscopiques comme la résonance magnétique nucléaire (RMN). Lors d’analyses de

Conclusions et Perspectives

liaison à l’ADN des bHLH-O, il a été observé que la quantité d’ADN radiomarqué retardé

était plus importante en présence de deux protéines différentes qu’en présence d’une seule

protéine. Cela suggère que les hétérodimères se fixent plus efficacement sur l’ADN que les

homodimères. Nous pourrions utiliser la méthode SELEX afin de vérifier si des éléments de

réponse spécifiques des hétérodimères existent.

Cependant, la démonstration de l’existence de l’interaction n’est pas une preuve

suffisante pour qu’elle soit significative au niveau physiologique. Les deux unités du dimère

HRT1-Hairy doivent présenter une expression spatio-temporelle identique. Egalement,

l’interaction doit être fonctionnelle, c’est à dire qu’à l’association de XHRT1 avec lui-même

ou avec une autre protéine doit correspondre un rôle biologique (activité transcriptionnelle,

catabolisme, etc..). Ces protéines sont des répresseurs de la transcription mais leurs cibles

communes ne sont pas encore connues. Nous pouvons émettre l’hypothèse que les cibles de

Hairy chez la drosophile (Bianchi-Frias et al., 2004) pourraient être celles des dimères

HES/Hairy-HRT. Une majorité de ces cibles possèdent des homologues chez les espèces

supérieures (comme par exemple Paired et les protéines PAX ou encore pointed et les facteurs

Ets1 et Ets2). Il est plausible que d’autres gènes régulés par le même dimère soient apparus au

cours de l’évolution. Nous pourrions le vérifier et rechercher les cibles par les méthodes

d’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP, Spencer et al., 2003) ou de détection de gènes

méthylés par des protéines de fusion avec la Dam méthylase (DamID, van Steensel et al.,

2001).

Les HRT et les HES/Hairy sont co-exprimés lors du développement ainsi qu’au stade

adulte. Il se pourrait que les dimères entre les protéines de ces familles bHLH-O aient un rôle

à jouer dans différents processus. La formation de dimères HES/HRT1 est à mettre au

conditionnel puisque son existence n’a pas encore été prouvée expérimentalement. Cependant

l’hétérodimérisation entre HES1 et HRT2 a déjà été observée lors d’expériences de

co-immunoprécipitation et de GST-Pulldown (Iso et al., 2001b). L’analyse de la liaison à

l’ADN par retard sur gel a identifié la boîte E de type C comme site de liaison à l’ADN de

haute affinité pour ce dimère. Lorsque HES1 et HRT2 sont surexprimés en lignée cellulaire

en présence d’un gène rapporteur sous dépendance d’un promoteur contenant la séquence de

la boîte E de type C multimérisée, ils présentent une activité répressionnelle en synergie (Iso

et al., 2001b). Puisque les domaines bHLH et Orange de HRT1 et HRT2 sont respectivement

Conclusions et Perspectives

similaires à 96 et 78%, nous pouvons suggérer que chez les mammifères, HES1 puisse

interagir avec HRT1 et former aussi un hétérodimère répresseur.

Lors de la neurogenèse chez le xénope, XHairy2b, XHairy1 et XHRT1 sont co-exprimés

(Taelman et al., 2004). L’équipe d’Andreazzoli (Andreazzoli et al., 2003) a montré que

XHairy2b inhibe la neurogenèse en tant qu’antagoniste des gènes proneuraux. Il en est de

même pour XHRT1. Chez le xénope, l’interaction HRT-Hairy serait donc impliquée dans le

mécanisme de différenciation neuronale. Chez la souris, la surexpression de HRT1/HRT2 ou

HES1/HES5 à certains stades du développement entraîne la maintenance plus tardive des

cellules précurseurs neurales et inhibe la neurogenèse (Ohtsuka et al., 1999; Ohtsuka et al.,

2001; Sakamoto et al., 2003; Wu et al., 2003). HRT1 et HES1 présentent donc des fonctions

similaires. Mais quel serait le mécanisme de répression ? Plusieurs groupes ont montré qu’il y

a répression de Mash1 (gène proneural) par HES1 (de la Pompa et al., 1997; Chen et al.,

1997). Le dimère HRT1-HES1 pourrait se lier sur un motif d’ADN présent dans le promoteur

du gène Mash1 et ainsi diminuer l’expression. Une autre possibilité du mécanisme de

répression serait que HRT1 et HES1 séquestrent chacun un monomère du complexe

activateur. En effet, HES1 et HRT1 inhibent séparément l’action des dimères activateurs

Mash1/E47 et Math3/E47 lors d’expériences de co-transfections ; de plus, HES1 interagit

avec E47 (Sasai et al., 1992; Sakamoto et al., 2003).

Dans le mésoderme présomitique (PSM) des vertébrés, HES1, HES5, HES7 et Hairy

présentent un profil d’expression cyclique (Jouve et al., 2000; Bessho et al., 2001; Palmeirim

et al., 1997; Davis et al., 2001). Les trois protéines de la famille HRT sont exprimées de

manière dynamique dans les somites (Nakagawa et al., 1999). Les différents dimères

possibles entre les HRT et les HES pourraient par conséquent être impliqués dans la

détermination des somites et de la segmentation. Les différents gènes candidats sous la

dépendance de cette régulation seraient Lnfg (Morales et al., 2002), les HES (Takebayashi et

al., 1994; Strom et al., 1997), et les HRT (Nakagawa et al., 2000).

La myogenèse permet de différencier les cellules précurseurs en cellules musculaires. HES1

et HRT1 sont capables d’inhiber la conversion myogénique induite par MyoD (Sasai et al.,

1992; Sun et al., 2001a). Le dimère HRT1/HES1 pourrait alors utiliser le même mécanisme

moléculaire que celui proposé précédemment concernant Mash1 (voir page précédente). De

Conclusions et Perspectives

plus, XHairy1 réprime l’expression de XMyoD et la myogenèse chez le xénope (Umbhauer et

al., 2001).

L’expression de HRT1 et de HES1 est modulése par TGFβ et BMP2 dans des lignées

précurseurs d’ostéoblastes (De Jong et al., 2004a). Runx2 est impliqué dans l’activité

transcriptionnelle de HES1 et inversément (McLarren et al., 2000; McLarren et al., 2001).

Quant à HRT1, il a été identifié comme nouveau régulateur de la différenciation

ostéoblastique (De Jong et al., 2004b). De plus, HRT1 réprime l’activité transcriptionnelle de

Runx2 (Zamurovic et al., 2004). En tenant compte de ces faits, le dimère répresseur

HRT1-HES1 pourrait alors jouer un rôle dans la différenciation ostéoblastique par interaction

avec l’activité transcriptionnelle de ces trois gènes.

Ni HES1 ni les protéines Hairy ne semblent jouer un rôle important dans le

développement du système cardiovasculaire. Mais HRT1 et HRT2 sont importants pour ce

développement (Fischer et Gessler, 2003; Fischer et al., 2004). La fonction des facteurs de la

famille HRT dans cette différenciation cellulaire a déjà été décrite dans l’introduction. Pour

rappel, les HRT modifieraient l’activité des facteurs de transcription ARNT et Hand, par

répression indirecte, et agiraient ainsi sur l’expression des gènes VEGFR2 ou VEGF.

Nous venons d’évoquer les différents processus dans lesquels les facteurs HES1 (Hairy) et

HRT1 sont ou seraient importants (neuro-, somito-, myo- et ostéogenèse). Pour valider ces

hypothèses, nous pourrions réaliser des doubles knock-out conditionnels HES1-HRT1 et en

étudier les conséquences pour le développement embryonnaire mais également au stade

adulte. La souris knock-out HES1 présente des défauts dans la formation du tube neural.

L’élimination supplémentaire de HRT1 chez la souris pourrait renforcer le phénotype ou avoir

différentes conséquences. En plus d’éliminer les gènes des deux bHLH-O, leur surexpression

permettrait de comparer les deux effets. Récemment, une équipe de l’université d’Oaka a

démontré que la surexpression des gènes bHLH Mash1 et NeuroD2 en cellules ES induit in

vitro la différenciation neuronale (Kanda et al., 2004). Une étude similaire sur HES1 et

HRT1, nous aiderait à mieux comprendre leur rôle. Concernant la neurulation, nous nous

attendons à observer un retard de la différenciation neurale comme obtenu indépendamment

pour HES1/HES5 et HRT1/HRT2 lors de surexpressions in vivo (Ohtsuka et al., 1999;

Ohtsuka et al., 2001; Sakamoto et al., 2003; Wu et al., 2003). La réalisation des mêmes

58

Conclusions et Perspectives

expériences sur des protéines de type bHLH-O sélectionnées en fonction de la différenciation

cellulaire étudiée permettrait probablement de mieux connaître la redondance de ces

protéines. Par exemple, pour l’étude de la somitogenèse, HES7 et les HRT pourraient être

utilisés tandis que les conséquences de la surexpression simultanée de HES1 et de HRT1

pourraient être étudiées dans la neurogenèse.

Passons à la troisième et dernière protéine étudiée, BOIP. Lors de nos recherches,

nous avons démontré qu’elle peut s’homodimériser et interagir avec HRT1 de manière

spécifique sans reconnaître apparemment d’autres bHLH-O.

Jusqu’à présent, parmi les gènes BOIP, seul le gène du poulet présente une structure en

intron-exon. Il serait intéressant de réaliser une analyse de l’évolution de la structure

génomique de BOIP.

Une question reste ouverte : le gène BOIP code-t-il vraiment une protéine ? En effet, nous

avons toujours utilisé la séquence BOIP en protéines de fusion et n’avons jamais détecté

l’existence de la protéine native. De plus, les profils d’expression réalisés étaient basés

uniquement sur les transcrits BOIP. La réalisation d’anticorps spécifiques s’impose afin de

répondre à la question soulevée. Nous avons comparé l’usage de codons pour BOIP et HRT1

chez le xénope, la souris et l’homme (programme gcua sur http://gcua.schoedl.de/). D’après

ces analyses, la séquence nucléotidique codant BOIP comprend en général les codons les plus

utilisés, comme la séquence codant HRT1, ce qui suggère qu’elle est bien traduite en protéine

BOIP in vivo.

Il faut remarquer que considérer la possibilité pour le gène BOIP d’être un ARN non codant

(ARNnc) n’est pas dénué de sens. Depuis quelques années, la découverte de transcrits non

codants et fonctionnels n’a cessé d’augmenter. Ils sont impliqués dans différents mécanismes

cellulaires : la formation des cellules germinales chez la drosophile (PGC, Nakamura et al.,

1996), l’inactivation du chromosome X et le phénomène de compensation du nombre de

copies des gènes situés sur le chromosome X (Xist/Tsix, Lee et al., 1999) ; rox1/2 Kelley et

Kuroda, 2000) ou l’activité transcriptionnelle (SRA, Lanz et al., 1999; Lanz et al., 2002).

Si BOIP est bien exprimé sous la forme d’une protéine quelle pourrait être sa fonction ?

D’après nos analyses bioinformatiques, la protéine BOIP ne contiendrait qu’un domaine

coiled-coil prédit dans sa moitié C-terminale. Aucun autre domaine connu n’a été identifié.

Dès lors, aucun élément structural ne permet de proposer des hypothèses concernant le rôle de

59

Conclusions et Perspectives

BOIP dans la cellule. Pour déterminer sa structure tridimensionnelle, il faudrait d’abord

produire la protéine pure en quantité suffisante pour ce type d’analyse. Ensuite, nous

pourrions utiliser la technique de la diffraction des rayons X, la RMN ou le dichroïsme

circulaire (CD, Keiderling, 2002; Oberg et al., 2004). Puis, nous pourrions comparer cette

structure avec les banques de données et peut-être obtenir des éléments permettant d’avoir une

idée plus précise concernant sa fonction.

Son expression spécifique lors de la spermatogenèse pourrait nous mettre sur la voie. Cette

étape de différenciation subit une régulation stricte et une transcription importante présageant

tous les remaniements nucléaires et structuraux qui donneront le spermatozoïde mature (pour

revue : Steger, 1999; Wolgemuth, 2003; Critchlow et al., 2004).

D’autres techniques pourraient nous renseigner directement sur la fonction de BOIP.

L’interférence ARN, technique relativement récente et prometteuse, serait utile pour observer

la réaction à la diminution de l’ARNm BOIP. La surexpression de BOIP dans des cellules

germinales (in vitro) pourraient être aussi utilisée (Parks et al., 2003). Les effets de

l’élimination ou de l’augmentation de BOIP sur la spermatogenèse pourraient alors être

analysés. Un des moyens les plus efficaces dans l’étude fonctionnelle est la réalisation de

knock-out. Le projet est en cours de réalisation à la section transgenèse de Biovallée par le Dr

Thierry Van Reeth.

Préparation du vecteur

Origine de l’insert

PCR Adaptateur ADN modèle ou plasmide d’origine. Plasmide de sous clonage post-PCR

Digestion

Constructions pPC97

NT-PIE fourni par le Dr D. Perez-Morga

XHRT1 bHLH-O 36-170 Sal I/Not I + XHRT1 complet (Pichon et al., 2002) PGEM®-T

XHRT1 TEIGAF 289-294 Sal I/Not I - + Sal I/Not I XHRT1 complet (Pichon et al., 2002) -

XHRT1 bHLH-O-IYT 1-294 Sma I/Spe I - EcoR I-rempli par la Klenow/Xba I

XHRT1 b-O-IYT 1-294∆58-95 Sma I/Spe I - EcoR I-rempli par la Klenow/Xba I

XHRT1 bHLH-IYT 1-294∆116-159 Sma I/Ksp I - EcoR I-rempli par la Klenow/Ksp I

XHRT1 IYT 160-294 Sma I/Ksp I -

pCDNA3 du même nom, thèse de Vincent Taelman en préparation

EcoR I-rempli par la Klenow/Ksp I

XHRT1 bHLH 1-114 Sma I/Spe I - pCS2+ du même nom, thèse de Vincent Taelman en

préparation ^{EcoR I-rempli par la Klenow/Xba I}

MHRT1 bHLH-O-IYT 2-299 Sma I/Not I - pGBK-Hey1 bHLH (Leimeister et al., 2000) Sma I/Not I

MHRT1 bHLH-O 38-175 Sma I/Not I - pGBK-Hey1 bHLH-Orange (Leimeister et al., 2000) Sma I/Not I

MHRT1 bHLH 39-121 Sma I/Not I - pGBK-Hey1 bHLH-Orange (Leimeister et al., 2000) Sma I/Not I

MHRT1 IYT 173-299 Sma I/Not I - pGBK-C-Terminus (Leimeister et al., 2000) Sma I/Not I

MHRT2 bHLH-O-I 1-271 Sma I/Not I - pGBKHey2-bHLH-Orange (Leimeister et al., 2000) EcoR I-rendu franc par la Mung Bean Nuclease/Not I

MHRT2 bHLH-O 1-173 - pPC97 MHRT2 bHLH-O-I 1-271 Nco I/Sac I

HHRT1 bHLH-O-IYT 1-304 Sal I/Not I - + Sal I/SacI Clone IMAGE 41903 HHRT1 (GenBank Acc R60704) Sac I/Not I

HHRT1 bHLH-O 1-178 Sal I/Not I + pPC97 HHRT1 bHLH-O-IYT 1-304 - Sal I/Not I

HHRT2 bHLH-O-IYT 31-336 V133A

Sal I-Mung Bean Nuclease/Bgl II

- Clone IMAGE 531909 (GenBank Acc AA116067) Sca I/Bgl II

HHRT2 bHLH-O-IYT 31-336 V133 HHRT2 bHLH-O-IYT 31-336 V133A Nco I

- Clone IMAGE 279176 (GenBank Acc N46845) Nco I

HHRT2 bHLH-O 31-175 Sal I/Not I + pPC97 HHRT2 31-336 V133 - Sal I/Not I

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