Lors des criblages, XHRT1 n’a pas été isolé parmi les proies potentielles. Cependant,
nous avons vérifié la présence de son ADNc dans la banque utilisée (voir II.A.2 et Figure 29).
Appât XHRT1
GAL4
DBD
H
C
O
H
C
O
Gal4
AD
H
C
O
H
C
O
H
C
O
GAL4
DBD
H
C
O
GAL4
DBD GAL4DBD
TOT - XHRT1 bHLH-O XHRT1 TOT 28S 18S-Figure 36 : Expression des ARNm chimèriques correspondant aux appâts XHRT1 complet (TOT) et bHLH-O (bHLH-O). (A) Vérification de la qualité des ARN testés par visualisation des ARN après coloration à l’acridine orange du gel
d’électrophorèse.
(B) Analyse par transfert de type Northern. La sonde radiomarquée utilisée correspond au domaine de liaison à l’ADN de Gal4. bHLH-O TOT B A bHLH-O
Gal4
AD
Gal4 UAS Gènes rapporteurs Gal4 UAS Gènes rapporteurs
Etat dimère appât Etat trimère appât-proie
Figure 37 : Hypothèse de la stabilisation des protéines appâts par la dimérisation du Gal4 DBD (hypothèse 3).
Le domaine de liaison à l’ADN de Gal4 (Gal4 DBD) doit former un dimère afin d’interagir avec sa séquence cible (Gal4 UAS). Il est possible que cette dimérisation stabilise l’interaction entre appâts au détriment de l’association avec la proie. Le cas où XHRT1 complet (HOC) est à la fois l’appât et la proie est représenté.
Si le dimère appât est très stable, la formation d’un trimère ou tétramère appât-proie qui active les gènes rapporteurs est alors défavorisée. Les phénotypes correspondant à l’activation des gènes rapporteurs ne sont donc pas observés de manière significative.
Résultats et Discussion
Nous avons testé l’homodimérisation de XHRT1 en double-hybride. Les levures, qui
contiennent comme appât la protéine XHRT1 complète ou ses domaines bHLH-O et la
protéine entière en proie, sont capables de croître uniquement sur un milieu carencé en
histidine (Figure 32). Les domaines bHLH et Orange sont donc importants pour
l’homodimérisation.
Rappelons que les facteurs de type bHLH doivent former des dimères pour se lier à l’ADN.
En effet, dans notre laboratoire, Bruno Pichon a mis en présence la protéine XHRT1 et des
séquences nucléotidiques « boîtes E », en absence d’autres protéines bHLH. Il a montré que
XHRT1 reconnaissait les séquences « boîtes E » de type B et C (Pichon et al., 2004). En
d’autres termes XHRT1 peut s’homodimériser.
Vincent Taelman a confirmé l’homodimérisation de XHRT1 par immunoprécipitation de
protéines étiquetées (Thèse en préparation de V. Taelman et Figure 34).
Cependant, nous observons lors du test en double-hybride que les levures contenant le couple
appât-proie XHRT1 complet présentent une croissance plus lente comparée à celle des levures
contenant le couple XHRT1 complet/XHRT1 bHLH-O (Figure 32).
Cette observation serait la conséquence d’une accumulation en plus grande quantité dans la
cellule des protéines de fusion ne contenant que les domaines bHLH-O. Cet effet pourrait être
dû à la synthèse plus abondante ou à une stabilité accrue de la protéine tronquée. Il a été
montré que, lorsque la protéine LexA est utilisée comme domaine de liaison à l’ADN,
l’expression de différentes protéines de fusion appâts varie (Golemis et Brent, 1992). Il
pourrait en être de même pour les protéines appâts contenant le Gal4 DBD. La mise en
évidence des protéines appâts utilisées dans notre système double-hybride n’a pas pu être
réalisée (voir II.A.1.), et c’est la présence des ARNm codant ces protéines appâts qui a été
vérifiée en utilisant le transfert de type Northern. La Figure 36 montre que les deux ARNm
correspondant aux deux protéines appâts sont présents en quantité équivalente. Ce résultat ne
signifie pas pour autant que les protéines appâts soient exprimées à un même niveau dans les
deux souches car l’efficacité de la traduction de ces deux ARNm pourrait être différente. Pour
en avoir confirmation, il serait souhaitable d’effectuer un transfert de type Western avec des
anticorps anti-Gal4 DBD plus spécifiques ou avec des anticorps anti bHLH-O de XHRT1.
D’autres hypothèses ont aussi été proposées pour expliquer nos observations :
(1) La présence des domaines C-terminaux de XHRT1 déstabiliserait l’interaction des
domaines bHLH dans le cadre des protéines de fusion utilisées.
Appât XHRT1 NT-PIE C -TOT 1-294 bHLH-O 36-170 Ade His β-gal TOT 1-294 C -bHLH-O 36-170 XHRT1 C -TOT 1-294 bHLH-O 36-170 XHRT1 TOT 1-294 C -bHLH-O 36-170 Proie XHRT1
b
b
Figure 38 : Test de l’hypothèse de la stabilisation des protéines appâts par la dimérisation du Gal4 DBD (hypothèse 3). Les diploïdes obtenus par conjugaison des clones exprimant respectivement les différentes protéines de fusion Gal4 DBD (appât) et AD (proie) sont testés sur milieu carencé en histidine contenant 1mM de 3-AT (His) ou en adénine (Ade). Le temps de croissance est de 3 jours. L’activité β-galactosidase (β-gal) a été visualisée dans les différents diploïdes obtenus.
Les protéines appâts testées sont le XHRT1 complet (XHRT1 TOT) et ses domaines bHLH-Orange (XHRT1 bHLH-O). En proie, le XHRT1 complet et ses domaines bHLH-O ont été utilisés. Les fragments de la protéine XHRT1 contenus dans chaque protéine appât ou proie, sont renseignés par leurs coordonées en acides aminés au sein de de la protéine complète. Le contrôle positif appât est la partie N-terminale du PIE8 (NT-PIE). Les contrôles négatifs (C -) sont le Gal4 DBD et le Gal4 AD seuls pour les appâts et les proies respectivement. Au dessous de la figure est représentée la structure de XHRT1 avec les positions des résidus délimitant les différents domaines ou motifs de la protéine. Les domaines et les motifs sont colorés en bleu pour le domaine basique (b), en rouge pour le domaine hélice-boucle-hélice (HLH); en orange, le domaine Orange (O); en bleu clair, la région intermédiaire (I), en jaune le motif YRPW et en vert le motif TEIGAF.
YRPW
YRPW
HLH
HLH OO II
117 117 100 100 58 58 45 45 159159 284284289289294294XHRT1
Résultats et Discussion
(2) Ces domaines recruteraient des protéines de levure qui défavorisent l’interaction avec la
protéine de fusion partenaire ou qui antagonisent l’action du domaine activateur de Gal4.
L’histone-désacétylase Sir2 est l’homologue de SIRT1 qui interagit avec HRT2, HES1 et
Hairy (Rosenberg et Parkhurst, 2002; Takata et Ishikawa, 2003). HRT1 pourrait
également interagir avec SIRT1 vu le degré de similitude entre les domaines bHLH de la
famille HRT, site de l’interaction. Il existe un cas proche du nôtre : Mad1 et Max, deux
protéines de type bHLH répresseurs, ne peuvent interagir de manière détectable en
double-hybride de levure qu’en absence de ySin3, un co-répresseur (Kasten et al., 1996).
Ceci peut s’expliquer par la formation d’un complexe ternaire Mad-Max-Sin3 dont
l’existence a été démontrée chez la souris (Ayer et al., 1995).
(3) La dimérisation du Gal4 DBD requise pour sa fixation à l’ADN stabiliserait l’interaction
entre protéines appâts au détriment de leur association avec la protéine proie. Cet effet
serait d’autant plus important que les protéines appâts sont complètes (Figure 37). La
chimère appât XHRT1 bHLH-O serait donc mieux à même de recruter la protéine proie
que le facteur XHRT1 complet sous la forme appât.
Lors des tests en double-hybride de levure, nous avons fait exprimer les différentes
combinaisons appât-proie possibles pour la protéine XHRT1 et ses domaines bHLH-O.
L’activation des trois gènes rapporteurs a été suivie (Figure 38).
Seul le couple appât-proie XHRT1 bHLH-O est capable d’activer HIS3, ADE2 et lacZ.
Le XHRT1 complet (en protéine appât ou proie) et ses domaines bHLH-Orange (sous la
forme de chimère complémentaire) ne donnent aux levures qui les expriment qu’un phénotype
histidine positif.
Après trois jours de croissance, les diploïdes contenant le couple appât-proie XHRT1 complet
ne sont pas capables d’activer les deux gènes de sélection nutritionnelle (HIS3 et ADE2). Ils
ne présentent pas non plus d’activation du gène lacZ. Selon l’hypothèse 3, la protéine appât
XHRT1 bHLH-O devait recruter son partenaire avec plus d’efficacité que la chimère appât
complète. Or le couple appât XHRT1 complet/proie XHRT1 bHLH-O donne des résultats
identiques à ceux du couple appât XHRT1 bHLH-O/proie XHRT1 complet. Ce qui nous a
amené à abandonner cette hypothèse.
Afin d’infirmer ou de confirmer l’hypothèse 2, il serait souhaitable d’utiliser des souches de
levures dans lesquelles des co-répresseurs sont absents, comme cela a été fait lors de l’étude
réalisée sur Mad et Max1 (Kasten et al., 1996).
pA
pA
pA
pA
ATG
ATG TGATGA
AATAAA
AATAAA ATTAAAATTAAA
48
L
L
C
C
Figure 39 : Les deux formes d’ADNc BOIP de xénope.
Les ADNc présentent une séquence codante de 1002 pb. Ils diffèrent par la taille de leur 3’UTR (forme longue L et forme courte C) qui résulte de l’utilisation de deux signaux de polyadénylation différents (AATAAA et ATTAAA). Le clone 22 présente une délétion interne de 48 pb dans la région codante qui ne change pas la phase de lecture. Cette délétion est représentée par un triangle renversé.
1 MPGGEGENRV GEGIQSLKQL HALPWDEKTE NEMLRSRLDE QSQLICMLKQ RADETQIKWQ 61 HLERVNGELE RQSGEAAQRF QSERERGERL EERFAILASN HQQMIRFKDE YKQQNEELRQ 121 LCDTMRESKY PELLHRDRCI QELRDQLGDT ETRLKEQEMN YGRKLDTLKA KVEQLEGEKR 181 TGSLELGDLT HRLKVSEETR HEAQEKLARL EEIKKAEKAE ADKRLEEIKK EKQELLNLCM 241 ERGRTLQDRQ REAAELSVRL QEAQKSLEKA EESYQRDKAA VDADIRVSDL QRKLEDGENQ 301 FEQLRRDFEA YKKHSGDLLT KERELNSKLR HLIG
Figure 40 : Structure secondaire potentielle de BOIP de xénope.
A partir de la séquence BOIP, le programme SMART (http://smart.embl-heidelberg.de) a suggéré que plus de la moitié de la protéine devait donner une structure de type « coiled-coil » (aa 100-318). La séquence représentée ici est celle du clone 3.