Environ 5 millions de doubles transformants (appât XHRT1 bHLH-Orange/banque
d’ADNc d’embryons de xénope au stade neurula) sont obtenus. Après étalement sur milieu
synthétique complet carencé en leucine, en tryptophane et en histidine avec 1 mM de 3-AT
(SC-L-W-H 1 mM 3-AT), 550 clones ont été sélectionnés. Ces clones positifs ont ensuite été
étalés sur milieu carencé en histidine et en adénine ; 485 clones ont pu croître.
Parmi ces 485 clones, 197 clones ont présenté une croissance plus rapide, reflétant
vraisemblablement les interactions les plus fortes. Sur ces 197 clones, l’expression d’activité
β-galactosidase, normalisée par rapport à celle du contrôle positif, a été mesurée. Ce qui nous
a permis d’être plus restrictif sur la sélection des clones potentiellement positifs. En effet, sur
tous les clones testés, 162 clones présentaient une activité β-galactosidase inférieure à 30% de
celle du contrôle positif; quant aux 35 clones restants, elle était comprise entre 30 et 100% de
celle-ci (Tableau 3). Les 25 clones dans lesquels l’activation du gène LacZ était la plus
importante, ont été sélectionnés pour la suite du travail.
Un des problèmes majeurs en double-hybride est la présence de faux positifs. Ces
derniers peuvent être le résultat de l’activation directe des gènes rapporteurs par une des
27
Résultats et Discussion
protéines de fusion issues de la banque d’ADNc ou de l’interaction d’une de ces protéines
avec le domaine de liaison à l’ADN de Gal4 présent dans la protéine de fusion appât. Dans le
but d’éliminer cette éventualité, les 25 constructions proies, après isolement, ont été
retransformées dans la souche de levure contenant le vecteur appât bHLH-O et dans la souche
de levure contenant le vecteur pPC97 sans insert (qui exprime le domaine de liaison à l’ADN
de Gal4 seul). Tous les co-transformants exprimant une proie et la protéine de fusion Gal4
DBD-bHLH-Orange ont été capables de croître sur milieu carencé en histidine et en adénine
contrairement aux levures transformées par une construction proie et le vecteur pPC97
(contrôle négatif appât).
Par la suite, les ADNc des partenaires potentiels ont été partiellement séquencés à l’aide
d’une amorce permettant la détermination de la phase de lecture issue de la fusion avec la
séquence codant le domaine de transactivation de Gal4. Ces séquences ont été comparées aux
banques de données par l’utilisation du logiciel BLAST, nous permettant de déterminer que
les 25 proies sélectionnées correspondent en fait aux 4 protéines différentes décrites ci-après :
XHairy 1 (GenBank AAA79185) et XHairy 2b (GenBank AAK63841).
Ce sont des facteurs de transcription à domaine bHLH-Orange appartenant à la
famille des Hairy & E(Spl). Pour chacune de ces deux proies, nous avons obtenu 3
clones indépendants. Pour XHairy2b, chacun de clones était présent en deux
exemplaires.
Pour les deux bHLH-O, un seul des trois clones contient la séquence complète de
la protéine (clone 24/6 : XHairy2b et clone 29 : XHairy1). Les deux autres codent des
protéines tronquées qui commencent au niveau du domaine basique (clone 28/8 :
XHairy2b et clone 14 : XHairy1) ou dans la boucle du domaine HLH (clone 15/10 :
XHairy2b et clone 18 : XHairy1). Une analyse plus approfondie de ces candidats
partenaires est décrite au point II.B.1.
BOIP (GenBank CAD87597 CAD 87603).
Il s’agit d’une protéine codée par une séquence qui n’avait pas encore été
caractérisée au moment de sa découverte. Ce candidat, dénommé par la suite BOIP pour
NT-PIE C -bH
Activité
β
-gal (
%
du NT-PIE)
-O 6 24 8 15 10 28 29 18 14 3 2 21 22 23 12 13 5 30 25 27 1 26 11 17 20XHairy 2b BOIP L « LIPa»
XHairy 1 BOIP C
Figure 30: Activation du gène rapporteur lacZdans les clones positifs isolés lors du criblage par l’appât bHLH-Orange. L’activitéβ-galactosidase (β-Gal) a été mesurée dans les extraits des différents clones par la méthode SDS-chloroforme et est exprimée en pourcentages de l’activité présente dans l’extrait correspondant au contrôle positif NT-PIE. Les différents clones sélectionnés sont répartis en fonction de la proie exprimée. La famille BOIP est séparée en deux groupes correspondant aux ADNc longs (L) et courts (C ). L’activitéβ-galactosidase exprimée par le clone contenant seulement la construction appât bHLH-Orange (bH-O) est montrée pour comparaison. Le contrôle négatif (C -) correspond à l’activitéβ-galactosidase présente dans l’extrait des levures exprimant le domaine de liaison à l’ADN de Gal4 seul.
Résultats et Discussion
Bc8 Orange Interacting Protein, a été retenu pour la plus grande partie de notre travail.
Une analyse plus détaillée de ce partenaire est exposée plus loin (point II.C.). BOIP est
représenté par 9 clones dont 7 indépendants, sous deux formes d’ADNc de longueurs
différentes (forme courte et longue). Sur ces sept clones, quatre codent une protéine
complète (Clones 3, 5/30, 12 et 13), tandis que les deux dernières correspondent à une
protéine tronquée (~ 230 aas sur 334, clones 21/23 et 22).
Une protéine homologue à la liprine lip1 α humaine (GenBank NP_803172).
Représentée par 7 clones dont 5 indépendants, elle est apparentée à la famille des
liprines connues pour interagir avec la tyrosine phosphatase transmembranaire LAR
(Serra-Pages et al., 1995; Serra-Pages et al., 1998). Toutes les proies obtenues codent des
protéines tronquées. Ces dernières contiennent entre 900 (Clones 1 et 25/26/27) et 1000
(Clones 1, 20 et 17) acides aminés sur les 1200 de la liprine entière. Les régions non
présentes dans les clones isolés ne correspondent pas à des domaines fonctionnels
connus de cette protéine.
Etant donné que la localisation subcellulaire des liprines semble être restreinte au
cytosquelette dans le cytoplasme et que seuls des clones correspondant à des protéines
tronquées ont été isolés, contrairement aux autres proies, l’interaction est suspectée de
n’avoir aucun fondement physiologique. Cette proie n’a donc pas été étudiée dans ce
travail.
La figure 30 reprend les résultats de la mesure de l’activité β-galactosidase des doubles
transformants appât bHLH-O/proies sélectionnés lors du criblage.
Par la suite, nous nous sommes demandés s’il n’y avait pas d’autres candidats potentiels
dans les 172 clones sélectionnés à l’issue des tests sur les trois gènes rapporteurs. 26 autres
clones choisis au hasard ont été séquencés partiellement. Les quatre protéines citées
précédemment ont été retrouvées mais la reconstitution de ces interactions n’a pas été
réalisée. La structure des clones supplémentaires isolés est décrite ci-dessous :
Toutes les cinq proies XHairy1 isolées correspondent à des clones indépendants qui
codent des protéines tronquées. La séquence protéique de trois d’entre elles commence à
0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 120,00 C+ C- 1 2 3 4 5 6 A cti vi té la cZ (% C + ) NT-PIE
Activité
β
-gal
(%
du N
T
-PIE)
Figure 31: Activation du gène rapporteur lacZdans les clones positifs isolés par l’appât TEIGAF.
L’activitéβ-galactosidase (β-Gal) a été mesurée dans les extraits des différents clones par la méthode SDS-chloroforme et est exprimée en pourcentages de l’activité présente dans l’extrait correspondant au contrôle positif NT-PIE. Les différents clones sélectionnés sont représentés par les chiffres 1 à 6. Le contrôle négatif (C -) correspond à l’activité
Résultats et Discussion
partir de la boucle du domaine HLH. Pour les deux dernières, elle débute à la fin ou après la
deuxième hélice du domaine HLH.
Parmi les onze clones XHairy2b isolés, sept sont indépendants et, six codent des
protéines complètes. Le dernier code une protéine délétée du domaine basique, de la première
hélice et de la boucle du domaine HLH.
Les quatre clones BOIP isolés étaient indépendants. Trois correspondent à des protéines
complètes tandis que la quatrième ne contient que la moitié C-terminale de la protéine.
Les deux proies Lip1 α isolées correspondent à un seul clone qui code une protéine ne
contenant que 900 acides aminés sur les 1200 que compte la protéine entière.
Une seule protéine différente a été obtenue. Il s’agit de XHairy2a (GenBank
AAK63841) pour laquelle 4 clones indépendants ont été isolés. Parmi ceux-ci, un ADNc est
complet et les trois autres codent des protéines tronquées dans le domaine basique. Ce facteur
de transcription est une isoforme de XHairy2b. Nous n’avons pas confirmé cette interaction
par reconstitution du double-hybride et ne l’avons donc pas étudiée en détail par la suite.
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(Page 73-78)