protéine E4orf4.
3.2 E4orf4 recrute les Rho GTPases dans les endomembranes.
Les petites GTPases de la famille Rho (Rho GTPases) sont les grands régulateurs de la dynamique de l'actine et sont impliquées, entre autres, dans la morphologie cellulaire, la mobilité, le transport vésiculaire et la transformation. Classiquement, les Rho GTPases RhoA, Racl et Cdc42 stimulent respectivement la formation de fibres de tension, de lamellipodes et de filipodes. Tel que décrit dans l'introduction, les GTPases peuvent se retrouver en amont ou en aval de la signalisation des tyrosine kinases. De plus, la génération de formes actives de certains de leurs effecteurs directs, par exemple la ROCK (Rho-activated kinase) et la PAK2 (p21-activated protein kinase 2) par les caspases a été impliquée dans les changements morphologiques cytoplasmiques et nucléaires de l'apoptose. En absence de l'activation des caspases, nous posons l'hypothèse que la signalisation induite par E4orf4 et Src mène au recrutement et à l'activation des GTPases et de certains de leur effecteurs. Ce recrutement mènerait à la réorganisation locale du cytosquelette d'actine et à la transmission du signal de mort cellulaire. Cette hypothèse s'appuie également sur des études de localisation des petites GTPases Racl, Cdc42 et RhoA en présence de E4orf4. Ces études seront présentées ici.
Un obstacle majeur à l'étude des Rho GTPases est l'absence de bons anticorps commerciaux suffisamment spécifiques pour reconnaître la protéine endogène lors d'études biochimiques ou d'immunofluorescence et pour discriminer les différentes isoformes et certains membres très semblables de la famille. C'est pourquoi nous avons été contraints d'exprimer de faibles quantités de formes exogènes des Rho GTPases, fusionnées avec GFP ou avec un épitope myc pour faciliter leur détection par immunofluorescence. Ainsi, en exprimant une faible quantité de Myc-Cdc42 ou de Myc-Racl avec E4orf4, j'ai été en mesure d'observer un recrutement très net des deux GTPases à la membrane plasmique et dans les endomembranes juxtanucléaires, chez les cellules présentant le phénotype de bourgeonnement cellulaire (figure 3-5A). Les images de la localisation des Myc-Cdc42 et Myc-Racl prises par microscopie confocale ont été analysées afin de quantifier l'accumulation des GTPases dans les deux compartiments membranaires. Pour ce faire, une
ligne a été tracée arbitrairement sur l'image de chacune des cellules partant du noyau (position 1) jusqu'à l'espace extracellulaire (position 2). La distribution de l'intensité moyenne de fluorescence le long de cette ligne a été rapportée graphiquement et correspond à la distribution relative de la GTPase entre les positions 1 et 2. Cette distribution graphique révèle deux pics bien distincts en présence de E4orf4. Le premier pic plus large, correspondrait aux endomembranes (EM). Le deuxième pic, plus fin, correspondrait à la membrane plasmique (MP) (graphiques, figure 3-5A).
La localisation et l'activation de Cdc42 au niveau des endomembranes est bien documentée. Notamment, Cdc42 stimule la polymérisation d'actine au Golgi350-355-431 r je
plus, l'activation de N-WASP par Cdc42 au niveau des endosomes de recyclage a été observée dans les cellules de cancer du sein 272. D'ailleurs, la distribution de Cdc42 dans la
cellule témoin (VV) montre un enrichissement important de la protéine au niveau des endomembranes (graphique, figure 3-5A) de même qu'à l'extrémité des filopodes (encadré, figure 3-5A). Par contre, le recrutement et l'activation de Racl au niveau des endomembranes est peu caractérisé. Il semble que Arf6, la petite GTPase qui coordonne le transport membranaire avec la dynamique de l'actine, facilite la redistribution de Racl à la membrane plasmique à partir des endosomes périphériques pour permettre la formation de lamellipode dans les cellules CHO et Hela ' . Les résultats semblent indiquer que Rac 1 est localisée préférentiellement à la membrane plasmique dans les cellules 293T contrôles (graphique, figure 3-5A,VV). Afin de déterminer la proportion des GTPases localisée au niveau des endomembranes et à la membrane plasmique en présence de E4orf4, le pourcentage de fluorescence dans chacun des pics a été calculé par rapport à la fluorescence de la ligne entière. Selon ce calcul, 56 % du Cdc42 et 52 % du Racl exogène serait situé au niveau des endomembranes en présence de E4orf4 (figure 3-5B).
A) Myc-cdc42
Figure 3-5 E4orf4 induit le recrutement membranaire de Cdc42, Racl et Rho. (A) Microscopie
confocale de la distribution de Myc-Cdc42 ou Myc-Racl (anti-myc 9E10) transfectés dans les cellules 293T seul (VV) ou avec Flag-E4orf4 (anti-E4orf4 (2419), non montré). L'encadré montre une vue en surface de la cellule correspondante. Le graphique représente la distribution de l'intensité de fluorescence correspondant au marquage de l'anti-myc entre la position 1 (noyau) et la position 2 (espace extracellulaire) le long de la ligne arbitraire. Les pics sur le graphique correspondent aux zones de fort recrutement. EM, endomembranes; MP, membrane plasmique. (B) Le pourcentage de recrutement aux endomembranes et à la membrane plasmique a été estimé en divisant l'intensité moyenne de fluorescence dans les pics représentant les endomembranes ou la membrane plasmique sur l'intensité moyenne de fluorescence le long de la ligne entière à partir d'images analysées selon la méthode décrites en A. Les données représentent la moyenne +/- SD. (C) Microscopie confocale de la distribution de Rho endogène (anti-RhoA) dans les cellules 293T transfectées avec le vecteur vide ou avec Flag-E4orf4 (anti-E4orf4 (2419)). Un marquage de l'actine-F a été réalisé avec la phalloïdine-A594 pour délimiter le contour des cellules transfectées avec le vecteur vide (VV). Barres, lOum.
Ce genre d'étude n'a pas été possible avec RhoA exogène puisque l'expression d'une faible quantité de Myc-RhoA modifie grandement la morphologie des cellules 293T qui expriment E4orf4 (non montré). Par contre, l'utilisation d'un anti-RhoA pouvant
l:M Ml1 position 2 EM MP position M l '
B)
Membranes % de recrutement Cdc42 Racl endomembranes 56+/-12 54+/-12 plasmique 8 + / - 3 12+/-3 n=l6 n=!2C)
i position 2 EM M P position Actine-F Vf
Rho endogène E4orf4r
Rho endogènereconnaître surtout RhoA, mais aussi RhoB et RhoC, a permis d'évaluer la localisation préférentielle de Rho endogène sur des cellules 293T exprimant ou non E4orf4. Malheureusement, le nombre d'images présentant un marquage assez net pour entreprendre l'étude de la distribution cellulaire de Rho endogène comme pour Myc-Cdc42 et Myc-Racl était insuffisant. Néanmoins, j'ai été en mesure d'observer un recrutement de Rho endogène dans les endomembranes juxtanucléaires en présence de E4orf4 (figure 3-5C). RhoB et RhoD sont connus pour leur localisation endosomale, tandis que RhoA et RhoC sont retrouvés au cytoplasme ou à la membrane plasmique 189' 432. L'anti-RhoA utilisé
reconnaît également la GTPase endosomale RhoB. D'ailleurs, il est possible de constater un marquage intracellulaire qui s'apparente au bruit de fond, dans la cellule témoin marquée par l'anti-RhoA (figure 3-5C). Cependant, l'intensité du marquage au niveau des endomembranes est manifestement plus important en présence de E4orf4, suggérant un recrutement de RhoA, B ou C dans ce compartiment.
Selon ces études de localisation, E4orf4 stimulerait l'accumulation des Rho GTPases Cdc42, Racl et Rho à la membrane plasmique mais surtout, au niveau des endomembranes situées dans une région juxtanucléaire non-définie. Puisque la localisation membranaire des Rho GTPases est associée avec leur activation par les GAPs et avec leur rencontre avec leur effecteurs, ce résultat suggère que E4orf4 dirige l'activité des GTPases vers ces sites membranaires intracellulaires. Cependant, ces études n'indiquent en rien si l'activité des GTPases est mise en cause dans l'activité toxique de la protéine. Cette question sera traitée au chapitre suivant.