La dynamique de Pactine induite par E4orf4 est associée avec la perturbation du trafic membranaire
5.1 E4orf4 perturbe le compartiment endosomal de recyclage
5.1.2 E4orf4 ralentit le recyclage de la transferrine et de son récepteur
L'effet très clair de E4orf4 sur le positionnement des endosomes de recyclage mène à l'hypothèse que E4orf4 puisse perturber le trafic endosomal de certaines protéines transmembranaires, soit en stimulant leur endocytose, soit en interférant avec leur recyclage vers la membrane plasmique. Afin de tester cette hypothèse, nous avons vérifié l'effet de E4orf4 sur le trafic du récepteur de la transferrine (TfR), communément utilisé pour l'étude du recyclage endocytique. Le TfR est internalisé avec son ligand, la transferrine (Tf), dans des puits recouverts de clathrine, puis recyclé vers la membrane plasmique, toujours avec
son ligand. Le trafic du TfR a été suivi grâce à l'utilisation du ligand Tf couplé à une molécule Alexa 594 (Tf-A594).
Des cellules MCF7 transfectées avec GFP ou avec E4orf4-GFP ont été incubées avec la Tf- A594 pendant 2 ou 30 minutes. Les cellules ont été fixées immédiatement ou suite à une incubation supplémentaire de 30 ou 60 minutes avec du milieu sans Tf-A594 pour permettre à la Tf fluorescente de retourner à la membrane plasmique. Les cellules ont été analysées par microscopie confocale en utilisant des paramètres d'acquisition constants pour chaque condition de manière à ce que l'intensité de fluorescence soit représentative de la quantité de Tf-A594 intracellulaire. Ces analyses montrent qu'après 2 ou 30 minutes d'incubation avec la Tf-A594, l'intensité moyenne de la fluorescence est la même avec ou sans E4orf4 (figure 5-5A, panneaux de gauche, 5-5B). Ces résultats indiquent que E4orf4 n'affecte pas l'endocytose de la Tf et de son récepteur. Après une période de chasse de 30 minutes avec du milieu sans Tf-A594, il y a une chute dramatique de la Tf-A594 intracellulaire en condition contrôle. En présence de E4orf4, la quantité de Tf-A594 intracellulaire résiduelle est 3x plus importante que dans les cellules témoins (figure 5-5A, panneaux de droite, 5-5B). Après 60 minutes de chasse, la Tf-A594 est presque entièrement recyclée vers l'extérieur dans les cellules témoins, tandis qu'une quantité 3x plus importante de Tf-A594 intracellulaire résiduelle est observée en présence de E4orf4 (figure 5-5B). Ceci démontre que E4orf4 ralentit le recyclage de la Tf et de son récepteur, sans toutefois le bloquer complètement. De plus, les analyses par microscopie confocale révèlent un important changement dans la distribution de la Tf-A594 en présence de E4orf4 (figure 5-5A), qui rappelle la distribution des endosomes décrit plus haut (figure 5-2). Dans les cellules témoins, la Tf-A594 se concentre dans le compartiment de recyclage qui est toujours visible, bien que dramatiquement réduit, après une chasse de 30 minutes. En présence de E4orf4, les endosomes contenant la Tf-594 s'alignent le long de structures fibrillaires dans les cellules plus allongées ou se concentrent dans un amas juxtanucléaire dans les cellules plus condensées. Ce marquage demeure très présent après 30 minutes de chasse, surtout pour les cellules plus condensées (figure 5-5A, panneaux du bas). Ces résultats sont cohérents avec le recrutement d'une population d'endosomes de recyclage marqué par le Tf-594 à l'anneau juxtanucléaire d'actine présenté aux chapitre 4 (figure 4- 5).
A)
Internalisation (30 min +Tf-A594) Chasse (30 min -Tf-A594)B)
E4orf4., - - <• % "* "" - ' E4orf4 . . . _ . . , - - , i > *• > E 4 o r f 4 < — --, * m i i t ■ i ■ \ ■ l *. '•. * *" ' • * . r / \ « / \ \ / E4orf4,- ,, : ^ "\ t i : \ *.' ~ " - * 30 Internalisation Chasse Tf-A594 90 Temps (min)Figure 5-5. E4orf4 ralentit le recyclage de la transferrine et de son récepteur. Les cellules MCF7 transfectées avec GFP ou avec E4orf4- GFP ont été incubées pendant 2 ou 30 minutes à 37°C avec la Tf-A594 qui est internalisée avec son récepteur. La Tf- A594 non-internalisée, associée avec la membrane extracellulaire, a été retirée grâce à un lavage avec un tampon acide à 4°C. Les cellules ont été fixées immédiatement (Internalisation) ou après incubation pendant 30 ou 60 minutes dans du milieu frais sans Tf- 594 pour permettre le recyclage de la Tf-A594 avec son récepteur (Chasse). (A) Images prises par microscopie confocale des cellules fixées après 30 minutes d'internalisation (à gauche) ou après 30 minutes de chasse. Toutes les images ont été acquises au plan focal le plus riche en Tf-A594 en conservant les mêmes paramètres d'acquisition. Le contour des cellules est délimité par la ligne pointillée. (B) La Tf-A594 intracellulaire a été quantifiée en mesurant l'intensité moyenne de fluorescence des cellules positives pour GFP ou E4orf4-GFP soumises aux différents temps d'incubation (n >25). Le moment où le milieu contenant la Tf- A594 a été remplacé par du milieu frais est indiqué par une ligne pointillée sur le graphique. Les données sont représentatives de deux expériences indépendantes (***p<0.0001).
Puisque E4orf4 semble ralentir le recyclage du TfR, une expérience supplémentaire a été réalisée afin de préciser l'étape défectueuse dans le trafic du récepteur en présence de E4orf4. Pour ce faire, l'intemalisation de la Tf-A594 pendant 30 minutes suivie d'une chasse de 30 minutes a été réalisée avec des cellules MCF7 exprimant des marqueurs pour différents compartiments endosomaux avec ou sans E4orf4. Normalement, le TfR
internalisé avec son ligand échappe à la dégradation par le lysosome (marqué par GFP- Rab7) et retourne à la membrane plasmique. Son recyclage peut se faire rapidement à partir des EPPs (marqués par GFP-Rab5) ou plus lentement suite à un arrêt transitoire dans le CRE (marqué par GFP-Rabll). C'est pourquoi après 30 minutes de chasse en chez les cellules témoins, la Tf-A594 résiduelle se retrouve majoritairement dans le CRE qui exprime GFP-Rabll mais ne colocalise ni avec GFP-Rab5, ni avec GFP-Rab7 (figure 5- 6A). En présence de E4orf4, la majorité du marquage résiduel de Tf-A594 colocalise aussi avec GFP-Rabl 1. Ceci signifie que le TfR est en mesure d'atteindre le CRE, même si celui- ci est délocalisé. 11 est également possible d'observer une légère colocalisation entre la Tf- A594 et GFP-Rab5, suggérant que le recyclage direct du TfR à partir des EPP est ralenti. Par contre, E4orf4 ne semble pas détourner le TfR vers une dégradation par le système endo-lysosomal puisque la colocalisation entre Tf-A594 et GFP-Rab7 est peu convainquante. Ces résultats suggèrent que la réduction de la mobilité des endosomes induite par E4orf4 influence la vitesse de recyclage du TfR mais n'interfère pas avec l'identité des compartiments membranaires visités par le TfR. D'après ces résultats, il est prévisible que le ralentissement du trafic endosomal par E4orf4 puisse avoir un impact sur les fonctions normales et l'homéostasie de la cellule.
Les résultats présentés ici sont cohérents avec les résultats présentés au chapitre 4 selon lesquels E4orf4 recrute une population d'endosomes de recyclage à l'anneau contractile d'actine et de myosine II par l'intermédiaire d'une comète d'actine. On peut proposer qu'en stimulant la formation d'une comète d'actine à la surface d'une population d'endosomes de recyclage, E4orf4 détourne ces endosomes et favorise leur ancrage sur les fibres d'actine. Cet ancrage entraînerait une réduction de leur mobilité qui interfère avec le recyclage vers la membrane plasmique de certaines protéines transmembranaires, comme le TfR.
A)
vv
B ) E4orf4
Figure 5-6. E4orf4 n'interfère pas avec l'identité des endosomes visités par le récepteur de la transferrine. Les cellules MCF7 transfectées avec les vecteurs codant pour des marqueurs de
différents compartiments endosomaux (GFP-Rab5, GFP-Rabl 1 ou GFP-Rab7), seuls ou avec E4orf4-mRFP ont été incubées pendant 30 minutes à 37°C avec la Tf-A594. La Tf-A594 associée avec la membrane extracellulaire a été retirée grâce à un lavage avec un tampon acide à 4°C. Les cellules ont été incubées pendant 30 minutes supplémentaires avec du milieu frais sans Tf-A594, puis ont subi un deuxième lavage avec un tampon acide à 4°C avant d'être fixées. Les images ont été prises en microscopie confocale. En (A), on peut voir la Tf-A594 intracellulaire persistante dans le compartiment de recyclage endosomal marqué par GFP-Rabl 1. En (B), on voit que même si la présence de E4orf4 semble modifier la position des trois types d'endosomes, la Tf persistante se retrouve tout de même enrichie au niveau des endosomes positifs pour Rab-11. Barres, lOjxm.