6.1 E4orf4 génère des changements dans la dynamique de
l'actine à partir des membranes cellulaires.
Une manifestation impressionnante de la réorganisation de l'actine induite par E4orf4, soit le bourgeonnement membranaire, est associée avec l'enrichissement de E4orf4 dans une fraction cytosolique et membranaire ' . Dans cette fraction, une proportion de E4orf4 est associée avec v-src exogène . Les travaux de Marie-Claude Gingras dans le laboratoire ont révélé l'importance de la phosphorylation de E4orf4 par Src pour sa localisation au niveau du cytoplasme et des membranes et pour la modulation de la signalisation de Src par E4orf4 . L'ensemble de ces travaux suggère que la phosphorylation de E4orf4 par Src est requise pour la formation de complexes de signalisation actifs impliqués dans la réorganisation de l'actine au niveau des membranes cellulaires. Les travaux présentés dans cette thèse vont plus loin et indiquent que l'association de E4orf4 avec Src est nécessaire à l'activation locale des régulateurs de l'actine RhoA, Racl et Cdc42 au niveau des membranes cellulaires.
6.1.1 Localisation membranaire de E4orf4
Les travaux présentés au chapitre 2 indiquent que E4orf4 induit deux voies alternatives de mort cellulaire programmée dans les cellules transformées. À partir du noyau, E4orf4 induit une mort lente, indépendante de Src et qui n'est pas associée au bourgeonnement cellulaire. À partir d'un compartiment cytosolique membranaire, E4orf4 induit une mort rapide dépendante de Src et précédée du bourgeonnement cellulaire 438. Des travaux ultérieurs ont
démontré que l'efficacité relative de ces deux voies est dépendante de la lignée cellulaire étudiée 406' 407. L'ancrage artificiel de E4orf4 aux membranes cellulaires par l'ajout de la
cellulaire et la condensation nucléaire dépendante de Src. De plus, un mutant non phosphorylable de E4orf4 muni de cette séquence CAAX est déficient pour l'induction du bourgeonnement cellulaire et de la condensation nucléaire, appuyant la thèse que la phosphorylation de E4orf4 par Src est nécessaire pour induire la mort cellulaire à partir des membranes. Ces résultats sont cohérents avec l'idée que Src et E4orf4 phosphorylée soutiennent la formation d'un complexe de signalisation au niveau des membranes cellulaires.
Le compartiment membranaire à partir duquel E4orf4 et Src signalent la mort cellulaire n'a pas été précisé à l'époque. D'ailleurs, il aurait été imprudent de déterminer ce compartiment en surexprimant E4orf4-GFP-CAAX. La séquence CAAX dicte une série de modifications posttraductionnelles de la protéine culminant par l'ajout d'un lipide de type farnésyl qui permet à la protéine d'intégrer la couche lipidique cytoplasmique de la membrane plasmique et des endosomes (pour synthèse, voir 9). Par conséquent, il aurait
été risqué de confondre la localisation membranaire normale de E4orf4 avec les compartiments membranaires où la protéine subit ces modifications, soient le réticulum endoplasmique et l'appareil de Golgi. Afin de valider le rôle de E4orf4 au niveau des membranes et d'identifier le compartiment membranaire impliqué, des études de localisation ont été entreprises avec la protéine E4orf4 sauvage fusionnée avec la GFP (E4orf4-GFP) ou la mRFP (E4orf4-mRFP).
L'enrichissement de E4of4-mRFP dans un compartiment membranaire tubulaire marqué de la flotiline-1-GFP a été observé dans les cellules MCF-7 (figure 5-7A). La flotiline-1 est une composante des radeaux lipidiques associée à l'endocytose indépendante de la clathrine et de la dynamine, mais dépendante de Cdc42, du cholestérol et des sphingolipides 335. Une
colocalisation entre E4orf4-GFP et un mutant de Arf6 (T27N) a également été observée dans des endosomes tubulaires (figure 5-7B). La petite GTPase Arf6 régule le trafic membranaire et la réorganisation du cytosquelette d'actine par son influence positive sur la production de P1P2 273. De plus, Arf6 (T27N) s'accumule dans un compartiment de
recyclage endosomal contenant des microdomaines riches en cholestérol et bloque le recyclage de certaines protéines membranaires de surface . La colocalisation de E4orf4 avec la flotiline-1 et avec Arf6 (T27N) suggère que E4orf4 transite dans des radeaux
lipidiques, dont ceux internalisés dans les endosomes de recyclage régulés par Arf6. L'association de E4orf4 avec des radeaux lipidiques est confirmée par la résistance d'une proportion du marquage de E4orf4-GFP lors d'une extraction au Triton X-100 à 4°C (figure 5-7B). En effet, l'insolubilité des radeaux lipidiques lors de ce type d'extraction a été
1 ' r 440 démontrée
En plus de la flotiline-1, les composantes connues des radeaux lipidiques sont des protéines transmembranaires telles que les récepteurs à activité tyrosine kinases (récepteurs TKs) et les intégrines, ou des composantes associées à la couche cytoplasmique des radeaux lipidiques. Dans cette deuxième catégorie, plusieurs molécules, notamment la PIP5K, le PIP2, les Rho GTPases et N-WASP, participent à la régulation de l'actine. L'accumulation de ces molécules dans les radeaux lipidiques contribuerait à la régulation locale de la dynamique de l'actine 441. L'ancrage de certaines SFKs (Lck, Fyn et Lyn) à la couche
cytoplasmique des radeaux lipidiques a également été démontré. D'après ces informations, il est possible de postuler que par son association avec les radeaux lipidiques, le complexe E4orf4-Src pourrait recruter et activer localement différents complexes de signalisation impliqués dans la réorganisation d'actine au niveau des membranes cellulaires.
6.1.2 Recrutement de complexes de polymérisation d'actine par E4orf4 et Src
au niveau des membranes cellulaires
Les expériences présentées au chapitre 4 (figure 4-6), basées sur l'utilisation de sondes fluorescentes reconnaissant les petites GTPases sous leur forme active, indiquent que E4orf4 active Cdc42, et possiblement Racl principalement au niveau des endomembranes juxtanucleaires. L'activation de RhoA est observée majoritairement au cortex de la cellule, mais également dans les endomembranes juxtanucleaires. Un mutant de E4orf4 (6RA) déficient pour la liaison à Src est déficient pour le recrutement de chacune des sondes, indiquant que la liaison entre E4orf4 et Src est nécessaire à l'activation locale de Cdc42, RhoA et Racl au niveau des membranes cellulaires.
L'expression de E4orf4 induit la formation d'un anneau juxtanucléaire d'actine et de myosine II relié au cortex cellulaire par des fibres de tension (figure 4-2C). L'utilisation d'inhibiteurs chimiques et de la technique de l'interférence à TARN a permis de disséqué le
rôle des GTPase RhoA, Racl et Cdc42 dans au moins deux types de régulation de l'actine impliqués dans la formation de cette structure (figures 4-7, 4-8). L'activation de la voie RhoA/ROCK/myosine II principalement au cortex cellulaire, est nécessaire à la formation de fibres de tension riches en actine et en myosine II qui s'ancrent aux points focaux d'adhérence, lesquels sont réorganisés en périphérie de la cellule en présence de E4orf4 408.
L'activité de Racl participerait avec RhoA à la formation de ces fibres, puisque l'inhibition de Racl n'affecte pas la formation des comètes d'actine mais inhibe la formation des fibres de tension. L'activation de la voie Cdc42/N-WASP/Arp2/3 quant à elle, stimule la formation de comètes d'actine au niveau des endosomes de recyclage marqués par Rabl 1, par la Tf et par GFP-GPI (voir figure 4-5), qui sont recrutés à l'anneau d'actine et de myosine II.
Les expériences présentées au chapitre 5 indiquent que les endosomes s'alignent le long des fibres d'actine induites par E4orf4 et se regroupent à l'anneau juxtanucléaire d'actine et de myosine II dans les cellules plus condensées (figure 5-3). De plus, l'étude de la mobilité des endosomes réalisée par microscopie à fluorescence en temps réel suggère que l'association des endosomes avec les fibres d'actine réduit leur mobilité (figure 5-4). La surexpression de formes actives de RhoB ou RhoD a été associée avec une diminution de la mobilité des endosomes suite à leur ancrage aux fibres d'actine. Cet ancrage nécessite le recrutement et l'activation d'une formine par Rho au niveau des endosomes, et la myosine II serait requise 345'347. Bien qu'on ne peut exclure la possibilité que la comète d'actine
induite par Cdc42/N-WASP/Arp2/3 serve elle-même à l'ancrage des endosomes sur les fibres d'actine, il est possible que E4orf4 active un autre complexe de polymérisation d'actine au niveau des endosomes, impliquant une formine. D'ailleurs, j'ai observé le recrutement de la formine GFP-dia2 dans une région juxtanucléaire dans les cellules MCF7 en présence de E4orf4 (résultats non présentés). Alors que le rôle des formines dans ce processus reste à démontrer, les résultats indiquent que la liaison entre E4orf4 et Src favorise l'activation locale des GTPases au niveau de la membrane plasmique et des endosomes de recyclage et suggèrent que la dynamique de l'actine découlant de cette activation affecte la mobilité des endosomes. Pour conclure, l'ensemble de ces résultats suggèrent que la protéine virale E4orf4 a évolué pour contrôler l'activation locale et différentielle de voies de signalisation distinctes qui coopèrent à l'assemblage de l'anneau
contractile. On peut donc postuler que la dynamique de l'actine est une cible majeure de l'action de E4orf4.
6.1.3 La dynamique de l'actine dictée par E4orf4 affecte le trafic endosomal
Plusieurs études récentes confirment qu'une régulation normale de la dynamique de l'actine est impliquée lors de plusieurs étapes du trafic membranaire, telles que l'endocytose, la fission vésiculaire, de même que la fusion vésiculaire. Les résultats présentés au chapitre 5 semblent indiquer qu'en modifiant la dynamique normale de l'actine, E4orf4 perturbe également le trafic membranaire. Cette conclusion s'appuie sur l'augmentation du mouvement rapide et directionnel observée chez une population d'endosomes, couplée à la réduction de la mobilité observée chez le reste des endosomes en présence de E4orf4 (figure 5-4), et par l'expérience de chasse réalisée avec la Tf marquée (figure 5-5). Cette expérience indique clairement que E4orf4 ralentit le recyclage de la Tf et de son récepteur sans interférer avec leur internalisation. À première vue, ce résultat peut sembler incohérent avec l'hypothèse que E4orf4 et Src modifie la dynamique de l'actine non seulement au niveau des endosomes mais également à la membrane plasmique. Cependant, considérant que E4orf4 semble associé aux radeaux lipidiques tandis que la Tf et son récepteur sont internalisés par la voie dépendante de la clathrine, il est possible que le complexe E4orf4- Src et la Tf puissent être internalisés par des mécanismes d'endocytose différents. Certaines données sous-tendent la convergence entre les différentes voies d'endocytose au niveau du compartiment de recyclage. Par exemple, une colocalisation partielle entre la Tf et l'intégrine (31, ou entre Arf6, TfR et Rabl 1 a été observée dans les cellules Hela et dans les cellules PC12 respectivement337'435. Selon cette hypothèse, la perturbation du recyclage de
la Tf serait une conséquence de l'action de E4orf4 au niveau du compartiment de recyclage endosomal et non au niveau de la membrane plasmique.
En plus des données supportant la localisation de E4orf4 dans les radeaux lipidiques, certains résultats permettent de proposer que E4orf4 favorise son internalisation en stimulant une voie d'endocytose dépendante des radeaux lipidiques. D'abord, E4orf4 semble stimuler la production de PIP2 (figure 5-8). Normalement, le PIP2 est synthétisé à la membrane plasmique par l'ajout d'un phosphate en position 5 du PIP par la PIP5K, un effecteur de Arf6 276. La surproduction de PIP2 causée par la surexpression de la PIP5K ou