Lien entre l'actine et le trafic membranaire : un rôle potentiel pour la dynamine en aval de E4orf4.

La dynamine 2 est une GTPase de haut poids moléculaire impliquée à plusieurs niveaux dans le trafic membranaire. Son activité GTPasique est nécessaire pour la fission vésiculaire non seulement lors de divers mécanismes d'endocytose dépendants et indépendants des puits couverts de clathrine, mais également lors de la fission de vésicules de transport à partir du CRE et de la partie trans du Golgi. La dynamine 2 possède un domaine PH lui permettant de lier les membranes riches en PIP2 d'où elle a la possibilité d'interagir avec plusieurs protéines impliquées dans la régulation de l'actine grâce à son domaine riche en prolines. Parmi les partenaires d'interaction de la dynamine, la profiline, la cortactine, Grb2, Nck, la syndaptine et l'intersectine lui permettent de s'associer à N- WASP et/ou à l'actine-F (pour synthèse, voir308). D'ailleurs, l'activité de la dynamine 2 est

impliquée dans divers processus reliant la dynamique de l'actine avec la déformation des membranes tel que l'endocytose, l'exocytose, la formation de podosomes, d'invadopodes, de lamellipodes et de coupe phagocytique (pour synthèse, voir ).

La dynamine est également retrouvée à la surface des vésicules propulsées par des comètes d'actine induites par la PIP5K, et un mutant de la dynamine 2 déficient pour sa liaison au GTP (dyn2 K44A) diminue la formation et le mouvement de ces vésicules ">' z"°. Tel que

décrit au chapitre 4, E4orf4 stimule la formation de comètes d'actine associée avec le recrutement d'endosomes dans une région juxtanucléaire (figure 4-5). De plus, les résultats décrits précédemment dans ce chapitre indiquent que E4orf4 perturbe le trafic membranaire (figures 5-4, 5-5) et favorise la formation de vésicules riches en PIP2 (figure 5-8). Puisque la dynamine est un substrat de Src 436'437, et qu'un lien fonctionnel entre différentes étapes

du trafic membranaire et la dynamique de l'actine lui a été attribuée 13, son activité est

susceptible d'intervenir dans les changements de la dynamique de l'actine induits par E4orf4.

Afin d'explorer cette possibilité, les cellules MCF7 ont été transfectées avec E4orf4-mRFP seul ou avec dyn2 (K44A)-GFP. L'effet de ce mutant de la dynamine 2 sur l'endocytose de

la Tf-A647 a d'abord été vérifié. Tel qu'attendu, la surexpression de la dyn2 K44A bloque complètement l'endocytose de la Tf-A647 dans les cellules témoins (figure 5-9A, panneaux de gauche). Par contre, bien que la dyn2 K44A diminue de manière très significative l'endocytose de la Tf-A647 en présence de E4orf4, on retrouve chez certaines cellules une légère accumulation de la Tf-A647 dans des structures tubulaires (figure 5-9A, panneaux de droite, cellules marquées d'une étoile). Ceci suggère que E4orf4 pourrait stimuler l'endocytose par un mécanisme indépendant de la dynamine. L'effet de la dyn2 K44A sur l'organisation des filaments d'actine en présence de E4orf4 a été étudié par microscopie confocale suite à un marquage des filaments d'actine avec la phalloïdine-A647. Les acquisitions sur deux plans focaux de la même cellule montrent l'amas compact de vésicules pourvues d'actine dans la région juxtanucléaire (flèche, figure 5-9B) et les fibres de stress qui relient cet amas à la périphérie de la cellule. L'expression de la dyn2 K44A mène à la formation de larges vésicules recouvertes d'actine-F (têtes de flèche, figure 5- 9B), mais semble interférer le recrutement des endosomes dans un amas compact (figure 5- 9B) normalement associé avec l'assemblage de l'anneau d'actine (figure 4-5).

Bien que l'activité GTPasique de la dyn2 K44A soit déficiente, son domaine riche en prolines est intact. Donc, on peut assumer que les interactions de ce mutant avec ses partenaires associés avec l'actine sont encore possibles. D'ailleurs, par le patron de localisation punctiforme de dyn2 K44A, on peut supposer un recrutement du mutant au niveau des membranes où se produit la polymérisation d'actine. Cependant, il semble que l'activité déficiente de la dyn2 K44A préviendrait la formation de nouvelles vésicules par fission, ce qui expliquerait la présence de larges vésicules recouvertes d'actine-F. De plus, même si les fibres de stress sont encore présentes à la base de la cellule, elles sont plus courtes et plus épaisses et ne sont pas reliées en un point juxtanucléaire, suggérant que l'activité de la dynamine est requise pour l'assemblage de l'anneau juxtanucléaire d'actine induite par E4orf4.

A ) dyn2 K44N-GFP Tf E4orf4-RFP dyn2 K44A-GFP Tf

Figure 5-9. Le mutant de la dynamine 2 (dyn2) K44A interfère avec la réorganisation d'actine induite par E4orf4. (A) Images de cellules MFC7 transfectées avec le mutant de dyn2 K44A seul ou avec E4orf4-mRFP prises par microscopie confocale. 24 heures après la transfection, les cellules ont été privées de sérum pendant 30 minutes puis ont été incubées en présence de la Tf-A594 pendant 45 minutes. Les cellules exprimant des niveaux suffisants de dyn2 K44A sont entourées d'un pointillé. À noter que la dyn2 K44A ne bloque pas complètement l'endocytose du TfR dans les cellules qui expriment E4orf4 (*). Barre, 30um. (B) Acquisition par microscopie confocale de deux plans focaux de la même cellule MCF7 transfectée avec E4orf4-mRFP seul ou avec dyn2 K.44A- GFP (panneaux du haut, section médiane; panneaux du bas, face ventrale). L'actine-F a été révélée par la phalloïdine-A647. La flèche indique le recrutement d'endosomes pour former l'anneau d'actine. Les têtes de flèche indiquent les larges vésicules recouvertes d'actine-F induites par l'expression de la dyn2 K44A-GFP. Barre, lOum

Selon ces résultats, la dynamine 2 pourrait participer aux changements de la dynamique de l'actine induits par E4orf4 en favorisant la formation de nouvelles vésicules endosomales par fission, lesquelles seraient propulsées par des comètes d'actine. Pour vérifier l'importance la dynamine dans la polymérisation de l'actine induite par E4orf4 aux endosomes, il faudait vérifier l'effet du mutant dyn2 APRD qui possède une activité GTPase intact mais qui est déficient pour la liaison des régulateurs de l'actine 298. La

5.4 Conclusions

En résumé, les travaux présentés dans ce chapitre soutiennent l'hypothèse présentée au chapitre 4 selon laquelle E4orf4 recrute une population d'endosomes de recyclage vers l'anneau d'actine et de myosine II par l'intermédiaire de la formation d'une comète d'actine à la surface de ces endosomes. Les résultats indiquent que la présence de E4orf4 détourne les endosomes de recyclage et favorise leur ancrage aux fibres d'actine. Cet ancrage a pour effet la réduction de leur mobilité et le ralentissement du trafic endosomal normal. Ce ralentissement est illustré par le retard du recyclage de la transferrine (Tf) et de son récepteur (TfR) à partir des endosomes vers la membrane plasmique.

La présence de E4orf4 dans un compartiment endosomal de recyclage riche en cholestérol régulé par la petite GTPase Arf6 suggère que E4orf4 perturbe le trafic membranaire à partir de ce compartiment. De plus, l'accumulation de PIP2 au niveau des membranes endosomales associées à des structures d'actine ressemblant à des comètes a été observée en présence de E4orf4. Puisque que la régulation de l'actine par Arf6 est connue pour dépendre de son action sur la production de PIP2, ces résultats suggèrent que E4orf4 stimule la dynamique de l'actine au niveau des endosomes par l'intermédiaire de Arf6 et de la production de PIP2. L'activité de la dynamine 2 serait impliquée dans la fission vésiculaire et potentiellement dans l'assemblage d'un complexe de polymérisation d'actine au niveau de ces endosomes. Il semble que le recrutement endosomal associé à la dynamique de l'actine à la surface de ces endosomes soit nécessaire à la formation de la structure d'actine et de myosine II dans la région juxtanucléaire induite par E4orf4. Le ralentissement du trafic membranaire qui découle de ce recrutement dépendant de la dynamique de l'actine est susceptible d'avoir un impact néfaste sur les fonctions normales et l'homéostasie de la cellule. Cet impact pourrait être un élément clé de l'activité toxique dépendante de Src, des Rho GTPases et de la dynamique de l'actine induite par E4orf4 dans les cellules transformées. Ces résultats supportent un rôle critique pour la dynamique de l'actine dans la mort cellulaire programmée.