Nouvelle méthode de préparation des protéoliposomes géants

Le principe de la méthode que nous avons mise au point avec J.-L. Rigaud (sur une suggestion de P. Méléard) consiste à utiliser des petits protéoliposomes comme mélange de départ, puis à les sécher et pour former ensuite les GUVs comme précé-demment. Cette méthode a été ensuite étendue à une autre protéine membranaire, l’ATPase Ca2+ par P. Girard au laboratoire. L’étape de séchage a été en particu-lier bien contrôlée pour cette protéine, plus fragile que la BR. Ces travaux sur la reconstitution de deux protéines membranaires en GUVs ont donné lieu à un article [Girard et al., 2004b]. Le protocole doit pouvoir être étendu maintenant à d’autres protéines.

Pour obtenir un mélange initial homogène de lipides et de protéines, la première étape a donc consisté à reconstituer la protéine en petits liposomes en utilisant les protocoles développés par Rigaud et al. [Rigaud et al., 1988; Levy et al., 1992; Rigaud and Levy, 2003]. Le principe est décrit sur le schéma de la figure III.20.

On prépare une solution de SUVs à 2 mg/ml. Pour cela on utilise une solution de lipides en chloroforme à 0.5 mg/ml, préparée comme indiqué au § A.1 p. 132, dont on va évaporer le solvant à l’évaporateur rotatif dans un petit ballon, puis terminer d’ôter le chloroforme dans une enceinte à vide (pression inférieure à 10 Pa). Puis, dans le ballon, on rajoute de l’eau ultra-pure pour atteindre une concentration de 2 mg/ml. L’ensemble est vortexé afin de mélanger l’eau au dépôt sur la paroi du ballon. A ce stade, la solution est laiteuse. Enfin l’ensemble est passé au sonicateur

Fig.III.20 – Représentation schématique des étapes de reconstitution d’une protéine membranaire en petits liposomes (ici dans le cas de l’ATPase N a+-K+, il y a dans ce protocole une étape de purification que nous n’avons pas à réaliser puisque la membrane pourpre ne contient que la BR) (d’après [Alberts et al., 1989]).

E. Fabrication de protéoliposomes géants

à pointe durant quelques minutes afin de former des SUVs ; la solution devient alors limpide, ce qui témoigne de la diminution de la taille des objets. Cette solution peut être conservée par congélation à l’azote liquide puis à −80◦C. Il faut cependant veiller à ne pas faire subir à la solution de SUVs un nombre trop grand de cycle congélation/décongélation, qui ont pour effet de faire grossir la taille des vésicule par un phénomène connu sous le nom de freeze-thraw (congélation-décongélation). E.2.1 Solubilisation de la protéine

La protéine doit être solubilisée avant son incorporation dans la membrane. Comme elle comporte des régions très hydrophobe, on ajoute pour cela un détergent, le triton X100 (voir fig. III.21) de sorte que le rapport Triton (en % masse/volume, soit mg/ml) sur la concentration de BR soit 0.2. On va alors agiter avec un agita-teur magnétique ce mélange au moins 12h en chambre froide afin de permettre une dissolution des aggrégats cristallins de BR sous forme de micelle mixte contenant à la fois des lipides natifs, une protéine et du détergent (voir fig. III.20). A ce stade,

Fig. III.21 – Formule du Triton X100.

la BR est très sensible à la lumière et peut se dénaturer sous l’action de celle-ci. On prendra donc toutes les précautions nécessaire pour protéger les échantillons de la lumière. Par ailleurs sous cette forme de micelle, la BR se dénature peu à peu même dans l’obscurité, on veillera donc à utiliser la BR solubilisée sous au plus 36 h. E.2.2 Reconstitution en petits liposomes

On va maintenant mélanger la protéine solubilisée avec les SUVs préparées pré-cédemment et avec du détergent, de sorte que le rapport poids/poids détergent sur lipide soit égal à deux. On laisse incuber 30 min, puis à l’aide de billes de polysty-rène poreuses (Biobeads SM2) on retire le détergent par adsorption. Les Biobeads sont injectées à raison de 40 mg par mg de Triton TX100 et ont préalablement été rincées au méthanol puis à l’eau ultra-pure. Le mélange est maintenu sous agitation durant 4 h. On obtient alors des SUVs contenant le lipide choisi, du lipide natif qui vient avec la BR et des traces de détergents (< 1 %) [Rigaud et al., 1998]. D’après les expériences que nous avons faites, on peut allez jusqu’à un rapport poids/poids lipides sur protéines de 7h dans les SUVs pour pouvoir fabriquer des GUVs.

h. soit dans le cas de la BR en SOPC (Masse moléculaire 788 g/mol) un rapport molaire de 231 lipides pour 1 protéine.

Ces petites vésicules peuvent être conservées de la même manière que les SUVs purement lipidiques obtenues précédemment.

E.2.3 Le dépôt

Le principe est de déposer une petite quantité de SUVs contenant la BR, de sécher partiellement l’ensemble puis de regonfler le tout par électroformation. Pour déter-miner les concentrations optimales (en lipides) des solutions de SUV permettant la fabrication des GUVs, on pratique des tests systématiques en déposant des quantités variant de 0.5 à 2 µl avec des concentrations de lipides entre 0.1 et 1.4 mg/ml sur des lame de verre recouvertes d’ITO. On a montré ainsi qu’il y avait un optimum pour une concentration entre 0.8 et 1 mg/ml avec des gouttes de 2 µl. Le séchage partiel se fait ensuite en plaçant cette lame une nuit dans une enceinte où la pression partielle de vapeur d’eau est fixée ; pour cela, on place au fond de l’enceinte une solution aqueuse, saturée en chlorure de sodium (NaCl). Enfin on fait pousser de la même manière que dans le cas des vésicules purement lipidiques.