A ce stade, les effets de l’activation de pompes ioniques a déjà pu être mis en évidence par la technique de micropipette. Il est cependant intéressant de développer une autre technique, moins perturbative que celle des micropipettes et qui permette une mesure indépendante de ces effets et plus encore, du spectre de fluctuation. Ceci constitue le but de cette thèse. Pour cela, afin d’aller au-delà des résultats obtenus par les micropipettes, nous avons développé une méthode de mesure du spectre de fluctuation ainsi que de la fonction d’autocorrélation temporelle à par-tir de l’analyse en temps réel du contour de vésicules géantes ; dans une première partie nous présenterons en détail la technique de reconnaissance de contours qui a été développée et en particulier les raffinement apportés aux techniques existantes (le chapitres II.1 p. 57 donnera un aperçu des techniques développées auparavant, les chapitres II.2 p. 77 et II.3 p. 105 exposeront la technique développée). Nous dé-taillerons le système expérimental au chapitre III.1 p. 131. Par ailleurs une nouvelle méthode de reconstitution de la BR en protéoliposomes géants a été mise en place permettant la préparation de liposomes avec une concentration contrôlée et homo-gène de protéines (chapitre III.2 p. 139). Puis les expériences faites sur les vésicules purement lipidiques permettant de tester notre méthode d’analyse de contours seront présentées (chapitre III.3 p. 167). Et enfin les expériences faites sur les membranes actives à l’aide de cette technique (chapitre III.4 p. 181).
Techniques de reconnaissance de
contours
Mesure du spectre de fluctuations et
des fonctions d’autocorrélation :
historique et état de l’art
E CHAPITRE va nous permettre d’avoir un aperçu des techniques qui ont été développées depuis les travaux pionniers de Brochard et Lenon pour mesurer les spectres de fluctuation et/ou les fonctions d’autocorrélation [Brochard and Lennon, 1975], jusqu’aux récentes publications par Méléard et al. [Pott and Méléard, 2002] et Döbereiner et al. [Döbereiner et al., 2003]. Nous allons passer en revue les étapes marquantes du développement de cette technique avec leurs principales caractéristiques, sans toutefois viser à l’exhaustivité. En effet de nombreux travaux ont été réalisés depuis les 30 dernières années ; les progrès de ces techniques sont aussi fortement liés aux progrès des caméras et des ordinateurs sur la même période.
A. Premières applications de l’analyse d’images à
l’analyse des fluctuations
A.1 Travaux sur les globules rouges
Les travaux de Brochard et al. sur le scintillement du globule rouge [Brochard and Lennon, 1975] ont permis de montrer pour la première fois que ce phénomène était dû aux fluctuations de membrane. C’est aussi la première utilisation d’une technique d’analyse d’images dans l’étude des fluctuations. En effet, les auteurs ont montré que si on supposait que ces globules avaient une tension de surface faible et que leur forme était due à l’énergie de courbure de la membrane dans des conditions physiologiques (voir fig. II.1), on pouvait alors relier les fluctuations d’épaisseur du globule rouge à celles de la membrane.
A. Premières applications de l’analyse d’images à l’analyse des fluctuations
Fig. II.1 – Image en contraste de phase de globules rouges dans des conditions physiologiques (d’après [Alberts et al., 1989]).
en contraste de phase du globule rouge et relient l’intensité en un point de celui-ci directement à son épaisseur. Ainsi ils ont alors mesuré les fonctions d’autocorrélation temporelle et de corrélation à deux points.
A.2 Travaux sur les vésicules géantes
A.2.1 Détection de quelques points particuliers du contour
Les premières expériences sur les vésicules lipidiques géantes ont été faites par Webb et al. [Schneider et al., 1984]. A l’aide d’une membrane lipidique marquée par un analogue de lipide fluorescent, les auteurs peuvent accéder à la position de la membrane au cours du temps en huit points de la vésicule. Dans cette première expérience de reconnaissance de contours proprement dite, la membrane est localisée comme le point de plus grande pente dans le profil de niveau de fluorescence pris perpendiculairement à la membrane (voir fig. II.2). De là, les auteurs tirent les fonctions d’autocorrélation en temps des fluctuations qu’ils relient au modèle de membrane disponible à l’époque où la membrane est représentée par un fluide à deux dimensions dans un milieu à bas nombre de Reynolds (comme l’eau à cette échelle) et qui peut être considéré comme visqueux ; ce modèle peut être ici assimilé au modèle standard de courbure (voir § B.1.2 p. 11 ou le tableau I.2 p. 15).
A.2.2 Détection de portions de contours
L’étape suivante est la détection de portions de contours. C’est ainsi que Bivas et al. [Bivas et al., 1987] proposent une détection de deux arcs du contour en DIC. A cause de l’absence de symétrie de révolution de l’image en DIC, y compris pour un objet possédant une symétrie de révolution, il n’est effectivement possible d’accéder qu’à une portion du contour (voir fig. II.3 p. 60). La position du contour est déter-minée par le point moyen entre le point d’intensité maximale et le point d’intensité
Fig.II.2 – Vision schématique de la reconnaissance de 8 points du contour de GUVs par la technique développée par Webb et al. Les points sont localisés comme l’en-droit de plus grande pente sur le profil d’intensité de fluorescence de la membrane contenant un marqueur fluorescent, profil pris perpendiculairement à la membrane (d’après [Schneider et al., 1984]).
minimale pris sur le profil des niveaux d’intensité le long d’une ligne horizontale cou-pant le contour. On peut noter que cette détection qui est limitée par l’asymétrie de l’image en DIC évoquée précédemment, n’est pas encore une forme évoluée d’algo-rithme permettant de prendre la membrane dans n’importe quelle position, mais un système où la membrane ne doit pas former un angle trop grand avec l’axe vertical. Par contre commence le développement de techniques qui auront une sophistication croissante pour identifier la position de la membrane.
En ce qui concerne les méthode d’analyse des résultats, le modèle en harmo-niques sphériques est introduit avec, à ce moment : là, le simple modèle de courbure spontanée (voir § B.1.2 p. 11 ou le tableau I.2 p. 15), et permet d’interpréter les résultats grâce à la fonction d’autocorrélation spatiale.
B. Vers des méthodes plus fines
Avec les progrès des ordinateurs va commencer à la fin des années 80 l’essor des techniques de reconnaissance de contours et d’analyse des fluctuations. Trois groupes vont dominer la technique de reconnaissance de contours proprement dite : Bivas, Faucon, Méléard et al. d’une part, Sackmann et al. d’autre part et enfin Döbereiner et al. Il est resté bien entendu de la place pour d’autres contributions dont certaines seront mentionnées dans ce qui va suivre.