Des membranes lipidiques ont été aussi partiellement ou entièrement polymé-risées. C’est ainsi qu’on a pu stabiliser un certain nombre de formes de vésicules de topologie complexe [Fourcade et al., 1992] ou des pores qu’on maintient ouverts grâce à la polymérisation sans que, comme c’est le cas pour les vésicules lipidiques ordinaires, le pore ne se cicatrise ou la vésicule n’éclate [Bradley et al., 1997].
C. Diverses techniques d’investigation des vésicules
géantes
De nombreuses techniques ont été développées au cours des années pour étudier les propriétés physiques des vésicules géantes. Nous allons maintenant présenter rapidement les principales techniques d’étude des vésicules géantes en ne donnant que le principe, et quelques références où le lecteur pourra trouver plus de détails sur leur utilisation. Il faut noter que les deux les plus utilisées sont la reconnaissance de contours et les micropipettes.
C.1 Observation directe, reconnaissance de contours
La technique la plus naturelle a été l’observation directe au microscope. C’est en effet un des grands avantages des vésicules géantes que de pouvoir être observées au microscope optique. Le principe général a été de détecter la position de la mem-brane (en partie ou totalement) et d’ensuite analyser les contours (ou une portion). La technique s’est développée de différentes façons aux cours des années. Nous dé-taillerons au chapitre II.1 p. 57 son évolution et son état actuel. C’est en effet cette technique que nous avons développée plus avant dans cette thèse.
C.2 Expériences de micropipettes
Une autre technique classique, mise au point par Evans [Evans and Needham, 1987; Evans and Rawicz, 1990] est l’utilisation de micropipettes. Elle consiste à «défroisser» la vésicule en l’aspirant dans une micropipette et à mesurer la relation entre la surface ainsi défroissée et la pression de succion appliquée à la membrane. L’analyse de l’excès de surface obtenu en mettant progressivement sous tension la vésicule permet de mesurer le module de rigidité de courbure, le module d’extension, et éventuellement la perméabilité par exemple [Rawicz et al., 2000]. Nous détaillerons plus cette technique au § B.1 p. 50.
C.3 Tubes de membranes
Il est possible de former des tubes de membranes lorsqu’on exerce une force localisée sur une vésicule géante. Ceci est possible en fixant un point de la vésicule et en la plaçant dans un flux [Waugh, 1982; Rossier et al., 2003], en utilisant la gravité [Bo and Waugh, 1989], ou en tirant sur la membrane par l’intermédiaire d’une bille piégée dans une pince optique [Raucher and Sheetz, 1999; Koster et al., 2003]. La force nécessaire pour tirer un tube dépend de la tension et du module de rigidité de courbure. La technique a été utilisée pour comparer les modules de rigidité de courbure de membranes, ou pour mesurer la friction intramembranaire [Evans and Yeung, 1994]. Cependant si la tension pouvait être fixée (par une micropipette par exemple), cette technique pourrait fournir assez facilement le module de rigidité de courbure de nombreux types de membranes à partir de la mesure de la force.
C.4 Diffusion de billes
Afin d’étudier les propriétés viscoélastiques de la bicouche en tant que fluide bidimensionnel, un expérience devenue maintenant classique est de mettre une ou plusieurs billes dans la membrane dont la mesure du déplacement (par le seul fait de la diffusion brownienne, par gravité, ou à l’aide de pince optique) va nous permettre la mesure du module de cisaillement, de la constante de diffusion, ou encore de manière indirecte le module de rigidité de courbure [Dimova et al., 2000].
C.5 Reflexion Contrast Interference Microscopy
Le principe de cette technique est de faire interférer les rayons réfléchis par la paroi de la vésicule et par la surface de la lamelle de verre. Moyennant un dispo-sitif de polarisation adapté on peut supprimer toute réflexion parasite [Rädler and Sackmann, 1993; Wiegand et al., 1998].
Ce système a été utilisé pour mesurer les fluctuations, mais s’est avéré assez li-mité dans cet usage [Rädler et al., 1995]. Son principal intérêt est plutôt l’étude de l’adhésion puisqu’on peut connaître avec une grande précision la distance entre le bas de la vésicule et la surface. Ainsi cette technique a permis l’étude par exemple de l’adhésion entre des surfaces chargées [Nardi et al., 1998], entre des surfaces et des vésicules décorées respectiement de ligands et de récepteurs [Bruinsma et al., 2000; Kloboucek et al., 1999; Boulbitch et al., 2001; Cuvelier and Nassoy, 2004] (voir fig. I.16).
C.6 Méthode d’étude en microscopie confocale
Dans les méthodes d’étude du spectre de fluctuation, on peut mentionner le déve-loppement récent d’une méthode originale de mesure des fluctuations, qui a conduit à la mesure de module de rigidité de courbure [Lee and Wang, 1997; Lee et al., 2001]. Le principe est le suivant (voir fig. I.17 p. 35) : en soumettant une vésicule à
C. Diverses techniques d’investigation des vésicules géantes
Fig. I.16 – Image d’une vésicule en adhésion sur un substrat. La partie centrale de l’image entourée d’anneau indique une zone où la vésicule est distante du sub-strat de moins d’une longueur d’onde de la lumière (monochromatique) utilisée ; La membrane est d’autant plus prés que la couleur est proche du noir. Les zones grises indiquent ainsi de l’adhésion faible quand les zones noire indique des zones d’adhé-sion forte. Chaque anneau autour de cette zone centrale indique alors que la distance a augmenté d’une longueur d’onde. (D’après [Bruinsma et al., 2000]).
un éclairage laser principal (Nd-Yag, voir fig. I.17), on peut calculer la pression de ra-diation sur la vésicule et calculer sa déformation et notamment son «écrasement» en connaissant ses paramètres physiques, notamment le module de rigidité de courbure. Par ailleurs en utilisant un deuxième laser de puissance plus faible que le premier
Fig. I.17 – Schéma de l’expérience de mesure du module de rigidité de courbure en microscopie confocale. LWP :filtre passe bas, PBS : Séparateur de faisceau selon la polarisation, PMT : tube Photomultiplicateur, PZT : commande piezzoélectrique, QWP : lame quart d’onde (d’après [Lee et al., 2001]).
et d’une autre longueur d’onde (He-Ne), pour l’observation uniquement, en plaçant la mise au point sur la membrane supérieure de la vésicule dans un montage de microscope confocal inversé avant l’éclairage avec le laser principal, on peut lorsque celui-ci exerce une pression sur la vésicule, calculer son déplacement par rapport au plan focal, à partir de la luminosité de la vésicule dans la couleur du laser secondaire, et remonter ainsi à sa déformation et finalement au module de rigidité de courbure.
C.7 Flux hydrodynamique
Le mouvement et la forme des vésicules posées sur une surface soumises à un flux hydrodynamique ont été étudiés à la fois théoriquement et expérimentalement [Cantat and Misbah, 1999; Seifert, 1999]. On observe un mélange de glissement et de roulement, et l’apparition d’une force verticale agissant sur la vésicule. Ces prévisions et ces mesures viennent donner un support physique à des problèmes biologiques tel le mouvement des globules blancs dans les capillaires sanguins.
C.8 Déformation sous champ magnétique/champ électriques
La déformation des vésicules sous champ électrique ou magnétique a été très tôt un moyen d’étude des vésicules ; c’est ainsi qu’Helfrich dés 1973 au moment où