On évalue par ailleurs χ ≃ kTρ , où ρ est la densité surfacique totale de protéines. Il faut noter toutefois que ces estimations ont été faites en utilisant les résultats des expériences de micropipettes [Manneville, 1999; Manneville et al., 2001] et que certains paramètres comme Ξ et Pa sont des grandeurs que nous espérions mesurer à l’aide de la technique d’analyse de contours.
A.3.2 Simplifications du spectre
Les vésicules que l’on observe ont un rayon de l’ordre de 10 µm, soit q⊥ > 105m−1. En supposant que la taille du dipôle est proche de l’épaisseur de la membrane, soit Pa
Fa ≃ w, on arrive à
λpFa ≪ Pa
4ηq⊥w (I.2.25)
On peut donc négliger le terme de perméation active devant le dipôle hydrodyna-mique actif pour les pompes. Par ailleurs, des ordres de grandeurs il vient
λp ≪ 1
4ηq⊥
(I.2.26) On négligera donc les termes de perméation. En négligeant ces termes, il vient le spectre de fluctuation dans le cas de la BR
hu(q⊥, t)u(−q⊥, t)i ≃ kT σq2 ⊥+ eκeeq4 ⊥ + kT [P2 aw2+ ΞPaw] χ(σ + eκq2 ⊥)(σ + eκeeq2 ⊥) (I.2.27) où eeκe =κee− PawΞ/χ et κee = κe− ρPaw et une relation similaire entre eκ et κ.
C’est donc ce spectre qu’on s’attend à mesurer. Il est composé de deux parties : une première partie correspondant à un spectre similaire aux membranes passives où le module de courbure est renormalisé et une nouvelle contribution qui fait ap-paraître l’activité de la protéine. On s’attend donc, d’après ce modèle, à mesurer un nouveau spectre de fluctuations et à observer une amplification des fluctuations due à l’activité des protéines. On peut à l’aide des ordre de grandeur proposés pré-cédemment faire une simulation des spectres attendues, qu’on trouvera fig. I.22. On remarque qu’à ce stade la différence entre membrane active et membrane passive parait faible. Néanmoins nous verrons au § A.1.1 p. 182 que la différence est plus marquée dans nos conditions d’observation.
B. Mise en évidence expérimentale préexistante
La première mise en évidence expérimentale de l’effet de l’activité d’une protéine sur les fluctuations a été réalisée sur la bactériorhodopsine à l’aide d’une expérience de micropipette [Manneville, 1999; Manneville et al., 2001].1e–27 1e–26 1e–25 1e–24 1e–23
200000 400000 600000 800000 1e+06 1.2e+06 1.4e+06 1.6e+06 1.8e+06 2e+06
<|u(q⊥)|²>
q⊥
Fig. I.22 – Simulation du spectre de fluctuation attendu pour une vésicule active (ligne) et une vésicule passive (point). La tension varie de σ = 10−8N/m pour les courbes bleues, σ = 10−7N/m pour les courbes verte, et σ = 10−6N/m pour les courbes jaunes.Les autres paramètres ont été fixé théoriquement à l’aide des estima-tions du § A.3 p. 47. On a la taille caractéristique du dipôle de force hydrodynamique fixée à w = 5× 10−9m, le module de rigidité de courbure à κ = 4 × 10−20J, la concentration surfacique de protéines ρ = 1016m−2, et la valeur du dipôle de force Pa = 4× 10−20J.m.
B. Mise en évidence expérimentale préexistante
B.1 Principe de la technique de micropipettes
Ces expériences consistent à défroisser une vésicule lipidique en l’aspirant avec une micropipette et à mesurer l’excès de surface par l’intermédiaire de la longueur de la «langue» aspirée. Cette méthode permet de fixer la tension en contrôlant la pression d’aspiration. Une telle expérience à l’avantage de donner une mesure de l’intégrale du spectre de fluctuation sur toutes les valeurs de q⊥, même très en-dessous de la résolution optique ; cela permet d’avoir une grande sensibilité et de mesurer des effets faibles sur les fluctuations. Cependant, cette technique ne permet pas de mesurer directement le spectre de fluctuations mais seulement une température effective.
On se reportera à la fig. I.23 pour une illustration de l’expérience.
Fig. I.23 – Une image d’une vésicule de EPC . La longueur de la «langue» aspirée dans la micropipette permet de remonter à l’excès de surface défroissé par aspiration. L’image est prise en DIC (voir [Inoué and Spring, 1997, pp. 89 sq.]). La barre représente 10 µm (d’après [Roux, 2003]).
Si Rv est le rayon initial de la vésicule,Rp le rayon intérieur de la micropipette, ∆P la différence de pression entre l’extérieur et l’intérieur de la micropipette, et ∆L la longueur de la langue, on a alors les expressions suivantes [Evans and Rawicz, 1990]: pour la tension σ = ∆P Rp 2 µ 1− Rp Rv ¶ (I.2.28)
et pour la dilatation d’aire
α = ∆S S = ∆L µ Rp Rv ¶2 − µ Rp Rv ¶3 2Rp (I.2.29)
On se reportera à [Manneville, 1999; Manneville et al., 2001] pour plus de détails sur la mise en oeuvre de l’expérience.
B.2 Résultats dans le cas de la BR
B.2.1 Excès de surface prédit par la théorie
L’excés de surface α est relié au spectre de fluctuation de la façon suivante [Helfrich and Servuss, 1984] :
α =h(∇⊥u)2/2i = 1 (2π)2 Z qmax 0 1 2q 2
⊥hu(q⊥)2i2πq⊥dq⊥ (I.2.30) Lorsqu’on va appliquer cette équation dans notre cas, nous ne pourrons pas mesurer l’ensemble des paramètres du système compte tenu que nous n’accédons qu’à l’intégrale du spectre de fluctuation. En conséquence, l’équation obtenue peut se mettre sous la même forme que dans le cas passif en changeant simplement la température par une température effective qui dépend des paramètres du système. On obtient donc : ∆α = α0− α = kT ef f 8πκe ln( σ σ0 ) (I.2.31) avec Tef f T = κe ee κe µ 1 + P2 aw2− ΞPaw eκχ ¶ (I.2.32) On notera la présence du module de rigidité de courbure renormalisé par la présence de la protéine (à cause du couplage courbure-diffusion) dans l’équation ; en effet bien que dans le cas de la BR Manneville et al. ne voit pas d’effet, nous verrons que pour d’autres protéines, il est visible. Cette équation a permis d’interpréter les résultats des expériences de micropipette à partir de la mesure de la pente de ln σ le logarithme de la tension en fonction de l’écart de dilatation d’aire par rapport à un état de référence ∆α, soit 8πκe
kTef f
.
B.2.2 Valeurs obtenue expérimentalement
Expérimentalement, J.-B. Manneville a observé une amplification des fluctua-tions due à l’activité de la bactériorhodopsine. De façon simple, on peut visualiser cet effet en comparant l’excès de surface mesuré à une tension donnée pour la mem-brane passive et la memmem-brane active (voir fig. I.24). L’ensemble des expériences a permis à J.-B. Manneville de montrer que la température effective de la membrane active était environ deux fois plus élevée que sa température thermodynamique. Par ailleurs, il n’a pas observé d’effet de la concentration en protéines (voir [Manneville et al., 2001]. Ce résultat est cohérent avec l’estimation venant des ordres de gran-deurs (certains paramètres ont été ajustés à partir des résultats expérimentaux, mais restent dans une gamme pertinente). On obtient, pour la gamme de concentration estimée, d’après I.2.32 :
1.7 . T
ef f
T .2.3
C’est aussi sur ce système de GUVs contenant la BR que nous allons utiliser une autre technique permettant de mesurer le spectre de fluctuation. Ceci nous permet
B. Mise en évidence expérimentale préexistante
Fig. I.24 – Effet de l’activité de la protéine sur les fluctuations. La mesure de la variation du logarithme de la tension ln σ en fonction de l’excès d’aire relatif ∆α suivant que la membrane soit passive (en noir) ou active (en gris) permet une mesure de la température effective. La pente est égale à 8πκ
e
kTef f
pour la membrane active et 8πκe
d’une part de tester les résultats de ces premières expériences et d’autre part une comparaison plus précise avec la théorie.
B.3 Expérience de micropipette sur la ATPase-Ca
2+Des expériences ont été réalisées récemment au laboratoire par P. Girard. Il a étudié une protéine capable de pomper des ions, l’ATP-ase Ca2+ qui en hydrolysant de l’ATP va permettre le passage de deux ions Calcium d’un coté à l’autre de la membrane. Une amplification des fluctuations encore plus importante a été mesu-rée avec cette protéine [Girard, 2004]. En effet, la température effective obtenue est Tef f ≃ 3T . Dans le cas de cette protéine, l’amplitude des changements de confor-mation liés au pompage est de l’ordre de 40 Å [Toyoshima et al., 2000], beaucoup plus important que pour la BR (3.5 Å). Le dipôle hydrodynamique a pu être mesuré (et non évalué comme dans les équations de J.-B. Manneville) et est égal à 8 kT . Cette protéine est beaucoup plus volumineuse que la BR ce qui peut expliquer que la renormalisation du module de rigidité de courbure par la protéine ait pu aussi être mesurable.