Cellule d’observation

Notre système a évolué au cours des expériences, nous n’en donnerons que les versions qui ont été utilisées pour faire les dernières mesures. Nous avons fait une bonne part des mesures sur les vésicules passives dans le système initial décrit dans l’annexe 1 p. 217, alors que les dernières mesures de vésicules passives et l’ensemble des mesures sur les membranes actives se sont faites dans la configuration simplifiée que nous allons décrire.

T=10 minutes T=32 minutes T=52 minutes T=95 minutes T=79 minutes T=123 minutes T=52 minutes T=79 minutes T=10 minutes T=32 minutes

Fig.III.2 – Image d’une préparation de vésicules d’EPC au cours de l’électroforma-tion

B. Système expérimental

Elle comporte deux lamelles de verres collées ensemble avec du parafilm que l’on fait fondre. Cela garantit une chambre inerte vis-à-vis des vésicules. La chambre est fermée sur trois coté et peut être fermée du quatrième coté afin d’éviter l’évaporation, avec de la pâte à sceller ou du l’huile minérale utilisée en électrophorèse. Ces produits sont eux aussi inertes. L’épaisseur de la chambre entre les lames est de 600 µm environ pour permettre le passage d’une «pipette cargo» utilisée pour le transfert des vésicules, et de 1 mm à l’extérieur pour satisfaire au faible espace séparant le condenseur et l’objectif lorsqu’il sont conjugués.

B.2 Protocole de fabrication et de remplissage de la cellule

d’observation

B.2.1 Traitement au PEG

Afin d’éviter l’adhésion des vésicules sur la lamelle de verre inférieure des chambres, celle-ci est recouverte d’un polymère hydrophile, le PolyEthylène Glycol (PEG ou PEO) greffé de manière covalente sur la lame de verre. Le protocole mis au point par P. Nassoy est le suivant [Nassoy, 2000]. Les manipulations sont à faire de pré-férence sous une hotte à flux laminaire pour éviter toute poussière qui viendraient se coller à la lame. On nettoie les lamelle à l’aide d’un mélange de 70 % d’acide sul-furique et 30 % de peroxyde d’hydrogène (Mélange «piranha»). Ce mélange très oxydant permet par ailleurs d’«activer» les silanols de surface de la lamelle de verre, favorisant ainsi la silanisation. Les lamelles sont rincées trois fois à l’eau distillée, puis deux fois au méthanol et sont ensuite laissées une nuit dans un mé-lange de 43 ml de méthanol, 2 ml d’eau distillée, 400 µl d’acide acétique et 1 ml de 3-MercaptoPropylTrimethoxySilane à 97 % (ABCR) (voir fig. III.3). La quantité cor-respond au volume nécessaire pour silaniser dix lames de 22 × 22 mm placées sur un support en téflon.

Fig. III.3 – Formule chimique du 3-MercaptoPropylTrimétoxySilane

Les lamelles sont ensuite rincées à nouveau au méthanol, séchées sous flux d’azote et mises 10 min au four à 120◦C. Une fois refroidies, elles sont placée dans du PBS (Phosphate Buffer Saline) à pH = 7.5, avec 0.14 mg de Mal-PEG (méthoxyPoly-Ethylène Glycol - Maléimide, Masse Moléculaire 5000) (voir fig. III.4) par cm2 de verre à traiter en veillant à diluer le moins possible pour éviter l’hydrolyse du Mal-PEG. La fonction maléimide réagit sur la fonction mercapto du silane déjà greffé.

CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-O

Fig. III.4 – Formule chimique du Mal-PEG

On laisse réagir quelques heures à température ambiante puis on rince à l’eau distillée et on sèche sous flux d’azote. Les lames sont alors conservées dans une enceinte à vide en attendant d’être utilisées. Nous avons vérifié par RICM (voir [Rädler et al., 1995]) que les vésicules n’adhèrent pas sur des lames préparées par ce procédé.

B.2.2 Transfert des vésicules

Les vésicules doivent être transférées de la chambre où a eu lieu l’électroformation vers celle où les observations vont se faire en minimisant les cisaillements d’autant plus que la vésicule se trouve fragilisée car on la transfère dans un milieu légèrement hyperosmotique. Pour cela, à l’aide d’un dispositif de micromanipulation pour micro-pipettes, nous aspirons doucement des vésicules, à l’aide d’une différence de pression de quelques centaines de Pascal dans un capillaire d’environ 400 µm de diamètre intérieur (Vitrocom), préalablement rempli de la même solution que celle où les vé-sicules ont poussé (sucrose 50 mM avec un tampon et des sels éventuels selon si on travaille sur des vésicules purement lipidiques ou contenant des protéines). Puis on sort doucement la pipette de la chambre de formation et on l’introduit dans la cellule d’observation où on expulse les vésicules dans la solution de glucose (typiquement glucose 54 mM, concentration que l’on peut faire varier en fonction de l’addition de tampon et de sels éventuels, ainsi que de la différence de pression osmotique désirée) à l’aide d’une légère surpression. Cette solution légèrement hyperosmotique permet de rendre les vésicules plus fluctuantes.

B.2.3 Observation et choix de la vésicule

La vésicule dont on veut effectuer l’étude est choisie loin de toute autre vési-cule ou poussière qui pourrait perturber la reconnaissance de contours et ainsi la mesure du spectre de fluctuation. Par ailleurs, on évite les vésicules présentant des défauts visibles optiquement (tubes, petits bourgeons (microbudding),. . . ) ; néan-moins il reste potentiellement des défauts à une échelle suboptique [Boroske and Elwenspoek, 1981; Häckl et al., 1997].

Un modèle de vésicule active

NE DES APPLICATIONS intéressantes de notre algorithme de reconnais-sance de contours est l’étude des membranes «actives». Nous nous sommes orientés vers des vésicules contenant la bactériorhodopsine (BR), une pompe à protons photoactivable, car l’effet de l’activité sur les fluctuations avait déjà été montré [Manneville et al., 2001]. Néanmoins notre technique pouvait donner des me-sures supplémentaires des paramètres physiques. Pour cela nous avons mis au point une nouvelle méthode permettant l’obtention de manière plus contrôlée que dans les expériences précédentes de GUVs contenant la protéine et effectué les tests pour valider ce protocole.

La bactériorhodopsine est une pompe à proton photoactivable qui est capable de transporter des protons contre un gradient de concentration en utilisant l’énergie lu-mineuse. Cela nous a permis d’observer sur une même vésicule les cas actif et passif, en changeant simplement un filtre sur le dispositif d’éclairement de la préparation (voir fig. III.5). La mise en œuvre expérimentale est beaucoup plus simple qu’avec des protéines où l’énergie provient d’un gradient d’ions (comme un gradient de protons pour les ATP-synthétases) ou l’hydrolyse de l’ATP comme pour la grande famille des ATPases.

A. La bactériorhodopsine, origine et structure

On trouvera une revue récente sur la structure, les relations structure-fonction, et le cycle de la BR dans [Haupts et al., 1999].