B Total lysate
3. NOUVEAUX RESULTATS : L’inactivation de WNK4 prévient la FHHt causée par la mutation Cul∆
Comme présenté dans la figure β de l’article, l’abondance de WNK4 augmente dans le rein des souris pgk-Cul3∆9. Je me suis donc intéressée au rôle joué par cette augmentation dans la pathogénèse de la FHHt. J'ai généré un modèle de souris porteur à la fois de la délétion de l’exon 9 ubiquitaire et d’une inactivation partielle (hétérozygote) ou totale (homozygote) de WNK4. L’inactivation d’un seul allèle de WNK4 (souris pgk-Cul3∆9:WNK4+/-) ne modifie pas le phénotype des souris pgk-Cul3∆9, tandis que l’inactivation complète de WNK4 (souris pgk-Cul3∆9:WNK4-/-) empêche le développement de la FHHt (Tableau 3). Les souris pgk- Cul3∆9:WNK4-/- présentent même un phénotype proche des souris WNK4-/-, avec une tendance à l’hypokaliémie et une alcalose métabolique hypochlorémique (Takahashi et al., 2014). Contrôles (n=6) pgk-Cul3∆9 WNK4+/+ (n=3) WNK4+/- (n=5) WNK4-/- (n=3) Plasma Na+ (mmol/L) Plasma K+ (mmol/L) Plasma Cl- (mmol/L) Plasma HCO3- (mmol/L)
145.2 ± 0,9 4.2 ± 0.2 109.8 ± 1.2 25.6 ± 0.4 148.0 ± 2.9 5.4 ± 0.2a 115 ± 0.6* 20.3 ± 1.6a 146.0 ± 0.8 5.1 ± 0.1a 116.0 ± 0.8a 21.5 ± 1.7 146.7 ± 0.7 3.9 ± 0.1*,b 107.7 ± 0.3b 26.1 ± 1.9 a,b
Tableau 3. L’inhibition génétique complète de WNK4 entraine une légère hypokaliémie et une alcalose métabolique hypochlorémique.
Les valeurs sont données en moyenne ± s.e.m. Analyse statistique : test de Kruskal-Wallis suivi par un test de Mann-Whitney.
*: p=0.0536; a p<0.05 vs souris contrôles; b p<0.05 vs souris pgk-Cul3∆9:WNK4+/-.
Dans le but d’expliquer ces différences de phénotypes, j'ai mesuré l’abondance et la phosphorylation de NCC chez les souris pgk-Cul3∆9:WNK4+/- et les souris pgk- Cul3∆9:WNK4-/-. L’inactivation totale de l’expression WNK4 entraine une diminution drastique de l’expression et de la phosphorylation de NCC (Figure β7). L'inactivation d'un allèle de WNK4 ne permet pas de diminuer l’abondance protéique de WNK4 chez les souris pgk-Cul3∆9:WNK4+/-, ce qui explique que l’abondance et la phosphorylation de NCC soient comparables entre les souris pgk-Cul3∆9 et les souris pgk-Cul3∆9:WNK4+/- (Figure 27).
Figure 27. L’inhibition génétique complète de WNK4 entraine une diminution drastique de l’expression et de la phosphorylation de NCC chez les souris pgk-Cul3∆9. Les valeurs sont données en moyenne ± s.e.m. Analyse statistique : test de Kruskal-Wallis suivi par un test de Mann-Whitney. Avant le western-blot, des gels contrôles ont été colorés avec du Bleu de Coomassie et les bandes représentatives de chaque échantillon ont été quantifiées afin de s’assurer de l’égalité de chargement entre les échantillons.
a p<0,05 vs. contrôles. b p<0,05 vs. pgk-Cul3Δ9. c p<0,05 vs. pgk-Cul3Δ9:WNK4+/-.
Afin d'évaluer le statut volémique de ces animaux, j'ai mesuré l’expression de l’ARNm rénine dans le rein. L’expression de la rénine tend à augmenter chez les souris pgk-Cul3Δ9:WNK4-/- (Figure β8). Il s’agit là de résultats très préliminaires qu’il conviendra évidemment de répéter sur un plus grand nombre d’animaux avant de pouvoir véritablement conclure. De plus, dès qu’un nouveau groupe expérimental sera disponible, il sera indispensable d’effectuer des mesures de pression artérielle.
pgk-Cul3D9 (n=4) Contrôles (n=6) NCC pNCC pgk-Cul3Δ9 :WNK4-/- (n=3) pgk-Cul3Δ9 :WNK4+/- (n=4) 0 200 400 600 N iv e a u d 'e x p re s s io n p ro té iq u e (u n ité a rb it ra ir e ) Contrôles (n=6) pgk-Cul3Δ9 (n=4) pgk-Cul3Δ9:WNK4+/-(n=4) pgk-Cul3Δ9:WNK4-/- (n=3) NCC pNCC a a a,b,c a a a,b,c a a a,b,c WNK4 WNK4
Figure 28. L’inhibition génétique complète de WNK4 semble prévenir l’hypertension artérielle observée chez les souris pgk-Cul3∆9.
Les valeurs sont données en moyenne ± s.e.m. Analyse statistique : test de Kruskal-Wallis suivi par un test de Mann-Whitney.
a p<0,05 vs. contrôles. b p<0,05 vs. pgk-Cul3Δ9. c p<0,05 vs. pgk-Cul3Δ9:WNK4+/-
Plusieurs études ont montré que L-WNK1 peut être recruté par KLHL3 pour une ubiquitination par le complexe ubiquitine-ligase CUL3/KLHL3 (Sasaki et al., 2017; Wakabayashi et al., 2013). L’expression protéique de L-WNK1 et WNK4 augmente chez les souris KLHL3+/R528H (Susa et al., 2014). Je n'ai pas été en mesure de quantifier le niveau protéique de L-WNK1 dans le rein des souris pgk-Cul3∆9 car nous n’avons pas en notre possession d’anticorps fiable capable de reconnaitre la protéine dans les tissus de souris. Le niveau protéique de L-WNK1 n’a également pas été quantifié chez les souris CUL3WT/∆403–459 (Schumacher et al., 2015). J'ai tout de même testé les conséquences d’une diminution de 50% de l’expression de L-WNK1 en croisant les souris pgk-Cul3∆9 avec le modèle d’inactivation de L-WNK1 généré par Zambrowicz et al. (Zambrowicz et al., 2003). Comme pour WNK4, la perte d'un allèle de WNK1 ne modifie pas le phénotype FHHt des souris pgk-Cul3∆9 (Tableau 4). Les conséquences d’une inhibition complète de L-WNK1 n’ont pas pu être testées, car elle entraine des défauts de développement cardiovasculaire et une mort in utero des embryons (Zambrowicz et al., 2003).
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 N iv e a u d 'e x p re s s io n d 'A R N R é n in e ( /u b c , u n ité a rb it ra ir e ) Contrôles (n=6) pgk-Cul3Δ9 (n=4) pgk-Cul3Δ9:WNK4+/- (n=4) pgk-Cul3Δ9:WNK4-/- (n=3) a a b,c
Tableau 4. L’inactivation d’un allèle de L-WNK1 ne modifie pas le phénotype des souris
pgk-Cul3∆9.
Les valeurs sont données en moyenne ± s.e.m. Analyse statistique : ANOVA à 1 facteur suivie d’un test de comparaisons multiples de Sidak. *: p<0.05 vs contrôles.
4. CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
Le modèle pgk-Cul3∆9 représente un modèle pertinent pour étudier la sévérité du phénotype FHHt associé aux mutations de CUL3. La comparaison des modèles pgk-Cul3∆9 et Sm22- Cul3∆9 a permis de démontrer que le phénotype vasculaire observé suite aux mutations Cul3∆9 est un phénomène primaire, indépendant de l’hypertension causée par la rétention de NaCl par NCC et que le phénotype sévère d’hypertension résulte du cumul d’une dysfonction vasculaire et d’une dysfonction du néphron distal. Nous avons montré que le phénotype vasculaire était vraisemblablement causé par une augmentation de l’abondance de RhoA et une altération de la voie de signalisation RhoA/ROCK entrainant une diminution de la vasodilatation des aortes des souris pgk-Cul3'9 et Sm22-Cul3'9. In vitro, nous avons montré que l’expression de la protéine mutante Culγ∆9 dans des cellules HEK293 entraine une augmentation de l’ubiquitination de l’adaptateur de substrat BACURD, spécifique de RhoA. Cela laisse supposer une augmentation de la dégradation de BACURD dans les cellules exprimant la mutation Culγ∆9 sans que l’on puisse formellement le démontrer en raison de la très longue demi-vie de BACURD et de la difficulté que nous avons à établir une cinétique. Des résultats obtenus précédemment in vitro ont montré que l’expression de Culγ∆9 n’entrainait pas de modification de l’expression de BACURD (Ibeawuchi et al., 2015). Toutefois, ces résultats peuvent être faussés par la très longue demi-vie de BACURD. Cul3 est capable de recruter des adaptateurs de substrats à domaines BTB divers et variés qui confèrent une spécificité de substrat à l’ubiquitination dépendante de Culγ (Pintard et al., 2004). In vitro, l’expression de la protéine mutante Culγ∆9 entraine une diminution de la dégradation de l’adaptateur de substrat RhoBTB1 (Ibeawuchi et al., 2015). D’autre part, les
Contrôles (n=6) pgk-Cul3∆9 (n=6) pgk-Cul3∆9:L-WNK1+/- (n=6)
Plasma Na+ (mmol/L) Plasma K+ (mmol/L) Plasma Cl- (mmol/L) Plasma HCO3- (mmol/L)
145.3 ± 0.7 4.4 ± 0.3 109.2 ± 0.6 25.0 ± 0.9 145.7 ± 1.1 5.1 ± 0.3* 115.7 ± 0.8* 19.8 ± 1.3* 148.0 ± 0.8 5.4 ± 0.3* 114.5 ± 0.4* 22.0 ± 0.7
adaptateurs de substrats RhoBTB1 et BACURD présentent une augmentation de la liaison à Culγ∆9 comparé à la liaison à CulγWT (Ibeawuchi et al., 2015). Une des hypothèses pour expliquer l’augmentation de l’abondance de RhoA chez les souris sm22-Cul3∆9 est que la mutation Cul3∆9, en augmentant l’abondance de RhoBTB1, va rendre cet adaptateur de substrat plus disponible que BACURD dont l’abondance diminue probablement en présence de la protéine mutante Culγ∆9. Cela va entrainer une augmentation du nombre de complexe ubiquitine-ligase Cul3 ciblant les substrats spécifiques de RhoBTB1 au dépend des complexes ciblant les substrats spécifiques de BACURD et notamment RhoA.
Nous avions précédemment montré que L-WNK1 joue un rôle important dans la contraction des cellules musculaires lisses vasculaires en conditions basales (Bergaya et al., 2011). De plus, les souris WNK3-/- sont résistantes à l'hypertension induite par l'angiotensine II, en partie à cause de la perte de l'activation de la phosphorylation de SPAK et NKCC1 (Zeniya et al., 2013). KLHL2 possède un domaine kelch très fortement similaire à celui de KLHL3, et il a été récemment proposé que le complexe KLHL2/CUL3 puisse fonctionner comme un complexe ubiquitine ligase capable d’interagir avec toutes les kinases WNK dans différents tissus, et notamment avec WNK3 et L-WNK1 dans le système vasculaire (Takahashi et al., 2013). La phosphorylation de NKCC1 n’est toutefois pas modifiée in vivo dans les aortes des souris sm22-Cul3∆9 et pgk-Cul3∆9, et ce, malgré une augmentation de l’expression et de la phosphorylation de SPAK. Il est donc possible que malgré les homologies entre KLHL2 et KLHLγ, la mutation Culγ∆9 impacte moins la stabilité du complexe ubiquitine-ligase KLHL2/CUL3 que celle du complexe KLHL3/CUL3. Il est également possible que le complexe ubiquitine-ligase KLHL2/CUL3 ne soit pas le mécanisme principal de régulation de l’expression de L-WNK1 et WNK3 dans les aortes, ce qui expliquerait que la mutation Cul3∆9 n'induise pas la phosphorylation et l’activation de NKCC1. Il est toutefois important de garder à l’esprit que l’existence d’un complexe KLHLβ/CULγ régulant l’expression de WNK3 et/ou L-WNK1 n’a jamais été démontrée in vivo.
En ce qui concerne le phénotype rénal, j’ai mis en évidence une activation de la voie de signalisation WNK4-SPAK-NCC dans le rein des souris pgk-Cul3∆9 mais pas dans celui des souris sm22-Cul3∆9. L’hypothèse est qu’une altération du complexe ubiquitine-ligase CULγ/KLHLγ soit responsable d’une diminution de l’ubiquitination de L-WNK1 et WNK4 entrainant une augmentation de leur abondance. Mes derniers résultats démontrent que WNK4 est indispensable au développement de la FHHt causée par les mutations Cul3∆9 (voir ci-dessus). Cela est en accord avec une étude très récente qui démontre un rôle tout aussi important de WNK4 dans la FHHt causée par les mutations de KLHL3 (Susa et al., 2017).
Afin de tester directement l'implication de WNK4 dans la FHHt causée par la mutation p.Arg528His de KLHL3, ces auteurs ont inactivé génétiquement WNK4 dans les souris KLHL3+/R528H (souris WNK4-/-;KLHL3+/R528H). La phosphorylation de SPAK et NCC diminue fortement dans le rein de ces souris et ce malgré l'augmentation de l'expression de L-WNK1 (Susa et al., 2017). Cette étude suggère que l’augmentation de l’expression de L-WNK1 n’est pas capable de compenser l’absence de WNK4. Ces résultats sont en contradiction avec les résultats obtenus dans le modèle WNK1+/FHHt, porteur d’une délétion de l’intron 1 de WNK1. Chez ces souris, l’augmentation de l’expression transcriptionnelle de L-WNK1 dans le DCT et le CNT est capable d’entrainer l’apparition de phénotype de FHHt (Vidal-Petiot et al., 2013), et ce même en absence de WNK4 (Chávez-Canales et al., 2014). Une première hypothèse pouvant expliquer cette contradiction est que l'expression de L-WNK1 est moins élevée chez les souris KLHL3+/R528H que chez les souris WNK1+/FHHt. Une deuxième hypothèse tient compte de l'expression de KS-WNK1. Chez les souris WNK1+/FHHt, seule l’expression transcriptionnelle de L-WNK1 augmente sans modification de l’expression de KS-WNK1 (Vidal-Petiot et al., 2013). Or des études in vitro et in vivo montrent que KS- WNK1 est un régulateur négatif de NCC (Hadchouel et al., 2010; Subramanya et al., 2006). Comme nous le verrons dans le chapitre suivant, nous avons très récemment montré que KS- WNK1 pourrait également être une cible du complexe ubiquitine-ligase CUL3/KLHL3. Son expression protéique pourrait donc être augmentée chez les souris KLHL3+/R528H et pgk- Cul3∆9. Dans ces conditions, KS-WNK1 pourrait donc inhiber la capacité de L-WNK1 à activer NCC chez les souris WNK4-/-;KLHL3+/R528H. La limitation à des investigations plus poussées est, une fois de plus, l’absence d’anticorps fiable capable de détecter et/ou de différencier L- et KS-WNK1 par western-blot.
Finalement, il est important de noter que cette étude ne nous a pas permis d’expliquer la sévérité des troubles métaboliques causés par les mutations Cul3∆9. Il conviendra donc à l’avenir de chercher de nouvelles pistes permettant d’expliquer cette différence de sévérité. Etant donné que KS-WNK1 semble également être une cible du complexe ubiquitine-ligase CULγ/KLHLγ, une des pistes à explorer concerne notamment l’inhibition de la sécrétion de potassium par KS-WNK1 chez les souris Cul3WT/∆403-459. In vivo, l’absence de KS-WNK1 entraine une augmentation de l’expression de ROMK dans le DCTβ chez les souris KS- WNK1-/- (Hadchouel et al., 2010). L’expression de ROMK a été étudiée par western-blot et immuno-fluoresence chez les souris Cul3WT/∆403-459 et aucune modification d’expression n’a été mise en évidence (Murthy et al., 2016). Cette absence de variation de ROMK est anormale puisque l’hyperkaliémie de ces souris devrait entrainer une augmentation de l'expression du
canal potassique. La sévérité de l’hyperkaliémie pourrait donc résulter du cumul de l’activation de NCC par WNK4 et de l’inhibition de ROMK par KS-WNK1.