c WNK4 : inhibiteur ou activateur de NCC ?

L’obtention de résultats discordants entre les expériences in vitro et in vivo a également compliqué la compréhension du rôle de WNK4 dans le transport de NaCl. Dans un premier temps, les études menées dans les oocytes de Xénope et les cellules en culture ont montré un effet inhibiteur de WNK4 sur l’activité de NCC (Wilson et al., 2003; Yang et al., 2003). Cependant, des études in vivo vont à l’encontre de ces études et suggèrent un rôle crucial de WNK4 dans le maintien de l'expression et l'activité de NCC dans le DCT. Dans deux modèles murins indépendants, l'inactivation de WNK4 entraîne une forte diminution de l'expression et de la phosphorylation de NCC, associée à une hypokaliémie et une alcalose métabolique hypochlorémique (Castañeda-Bueno et al., 2012; Takahashi et al., 2014).

Comment expliquer cette discordance entre expériences in vitro et in vivo ? Une hypothèse est qu'il existe une ou plusieurs différence(s) entre les cellules natives du DCT et les modèles in vitro utilisés. Plusieurs études ont suggéré que l’activité des WNK est modulée par des changements de concentration extracellulaire de sodium, potassium ou chlorure (Naito et al., 2011). Ceci est cohérent avec le fait que NKCC1 est activé ou inhibé respectivement par une diminution ou une augmentation de [Cl-]i et que cette activation est associée à une augmentation de sa phosphorylation par SPAK et OSR1 sur des résidus clés N-terminaux (Lytle and Forbush, 1996; Pacheco-Alvarez et al., 2006, 2012; Ponce-Coria et al., 2008). Une étude plus récente a montré que le niveau d'activité kinase de L-WNK1 est inversement proportionnel à la concentration intracellulaire en chlorure (Piala et al., 2014). L’activation de L-WNK1 requiert la phosphorylation d’une sérine (Sγ8β) située dans la boucle d’activation

du domaine kinase. La fixation de chlorure dans une "poche" située dans le domaine kinase empêche la phosphorylation de ce résidu, en modifiant la conformation de ce domaine. Ainsi, plus la concentration de chlorure est importante, moins l’activité de L-WNK1 est élevée. Les résidus leucine L369 et L371 jouent un rôle crucial dans la formation du site de fixation pour le chlorure dans le domaine kinase. En effet, leur mutation en phénylalanine diminue la sensibilité de L-WNK1 au chlorure (Piala et al., 2014).

La concentration en chlorure dans les modèles cellulaires in vitro est plus élevée que celle observée dans les cellules du DCT (40-50mM (Bazúa-Valenti et al., 2015) versus 10-20mM (Boettger et al., 2002). Les effets divergents de WNK4 sur NCC pourraient donc résulter de cette différence de concentration intracellulaire en chlorure. En effet, les résidus leucine décrits ci-dessus sont conservés dans la protéine WNK4, ce qui laisse penser que l'activité de WNK4 pourrait également être régulée par la [Cl-]i. Cette hypothèse est confirmée par l'augmentation de la phosphorylation de la boucle d’activation de WNK4 (Sγγβ) lorsque la concentration intracellulaire de chlorure diminue dans l'ovocyte de Xénope (Bazúa-Valenti et al., 2015). En conditions standard, la co-injection de NCC et de WNK4 dans l’œuf de Xénope résulte en une diminution de l'activité du co-transporteur. Cependant, WNK4 active NCC lorsque la concentration intracellulaire de chlorure est abaissée expérimentalement (Bazúa- Valenti et al., 2015). Cette étude de l'équipe de G. Gamba permet donc d'expliquer pourquoi WNK4 inhibe NCC in vitro alors qu'il l'active in vivo.

Bien que le site de fixation du chlorure soit conservé parmi toutes les kinases WNK, elles ne possèdent pas la même sensibilité au chlorure in vitro. L-WNK1 est capable d’activer NCC dans l’œuf de Xénope en conditions standard tandis que la concentration intracellulaire de chlorure ([Cl-]i) doit être abaissée pour que WNK4 soit capable d’activer NCC. En effet, l’activité kinase de WNK4 diminue progressivement lorsque la concentration intracellulaire en chlorure augmente de 10 a 40 mM, alors que celle de L-WNK1 est stable aux mêmes concentrations et ne commence a diminuer que lorsque cette concentration atteint 60 mM. La sensibilité de L-WNK1 au chlorure est donc plus faible que celle de WNK4. L'ensemble de ces données in vivo et in vitro suggère que WNK4 est le régulateur clé de NCC dans le DCT (Terker et al., 2015, 2016a).

Comme indiqué dans le paragraphe 2.4.1 de cette introduction, les WNK forment des homodimères ou hétérodimères grâce au petit motif HQ (HIQEVVSLQT) présent dans leur domaine coiled-coil C-terminal (Thastrup et al., 2012). L’interaction entre les WNK est requise pour leur activité puisque le mutant L-WNK1-HQ n’est plus capable d’activer NCC (Chávez-Canales et al., 2014). Lorsqu’ils interagissent sous forme de complexe, les WNK

sont capables de s’autophosphoryler en trans, sur leur propre boucle-T d’activation (Thastrup et al., 2012). Dans un environnement riche en chlorure, WNK4 n’est pas autophosphorylé, une condition dans laquelle il peut interagir avec L-WNK1 et inhiber son activité. Dans un environnement faible en chlorure, l’autophosphorylation de WNK4 rend la kinase active ce qui lui permet d’être fonctionnelle et d’activer NCC (Figure 1γ) (Bazúa-Valenti and Gamba, 2015).

Figure 13. Modèle proposé pour la régulation de NCC par les kinases WNK. L’activité de WNK1 et WNK4 est modulée par la [Cl-]i. Quand la [Cl-]i est haute, WNK4 et WNK1 ne sont pas phosphorylés et ne peuvent pas activer SPAK/NCC. L’absence de la leucine critique pour la fixation de chlorure dans le mutant WNK4-L322F permet à WNK4 d’activer SPAK et NCC. Quand la [Cl-]i diminue, WNK4 et WNK1 sont phosphorylés et peuvent activer SPAK et NCC. Adapté de Bazua-Valenti and Gamba, 2015 et Hadchouet et al., 2016.