Les mutations de WNK4 empêchent son interaction avec KLHL3 Les mutations retrouvées dans le gène WNK4 sont des mutations faux-sens localisées dans

deux courts motifs protéiques très conservés entre les membres de la famille des WNK et situés en aval des deux domaines coiled-coil (Figure). La majorité de ces mutations est cependant retrouvée dans le motif acide situé en aval du premier domaine coiled-coil. Ces mutations remplacent des charges négatives par des charges positives (Golbang et al., 2005; Wilson et al., 2001).

Figure 24. Les mutations de WNK4 impliquées dans la FHHt.

Les mutations identifiées chez les patients FHHt sont des mutations faux-sens conduisant à une modification de charges négatives en charges positives dans deux domaines conservés (en bleu) en aval des deux domaines coiled-coil (en violet). Adapté de Wilson et al., 2001 ; Golbang et al., 2005 ; Gong et al., 2008 et Zhang et al., 2011.

Les conséquences de ces mutations sont restées longtemps inconnues. Contrairement à la majorité des mutations, la mutation p.Arg1185Cys est localisée dans la région C-terminale de WNK4, au sein d’un site de fixation à la calmoduline (CaM) et à proximité des sites de phosphorylation par SGK1 Ser1190, Ser1201 et Ser1217 (Na et al., 2013). La phosphorylation du site S1201 est inhibée par la CaM. La mutation p.Arg1185Cys réduit l'interaction entre WNK4 et CaM et augmente donc la phosphorylation de Ser1201. Dans l’œuf de Xénope, la mutation p.Arg1185Cys entraine une augmentation de l’activité de WNK4 (Na et al., 2013).

Une étude biochimique a montré que l’activité kinase de WNK4 pouvait être régulée par les ions Ca2+ et que les mutations identifiées chez les patients FHHt dans les domaines acides de WNK4 pouvaient altérer cette régulation (Na et al., 2012). La stimulation du récepteur à l’AngII ATR1 entraine une augmentation de la concentration intracellulaire de Ca2+ _{(Liu and} Persson, 2004). Cela a poussé les auteurs à étudier la régulation de WNK4 par la concentration de Ca2+. In vitro, l'activité de WNK4 est corrélée positivement à la concentration de Ca2+. L’introduction des mutations du domaine acide dérégule le mécanisme

senseur de Ca2+ _{et augmente l'activité kinase de WNK4, indépendamment de la concentration} de Ca2+. Ce mécanisme n'a cependant pas été confirmé in vivo.

Cependant, une autre série d'études a démontré d'abord in vitro puis in vivo que les mutations du domaine acide de WNK4 perturbent son interaction avec KLHL3. Ce domaine est en effet le domaine par lequel WNK4 interagit avec le domaine Kelch de KLHL3 (Ohta et al., 2013; Wakabayashi et al., 2013). Les protéines WNK4 porteuses d'une mutation du domaine acide identifiée chez les patients atteints de FHHt n'interagissent plus avec KLHL3 et ne sont donc plus ubiquitinées et dégradées (Ohta et al., 2013; Shibata et al., 2013b; Wakabayashi et al., 2013; Wu and Peng, 2013).

Plusieurs modèles de souris ont ensuite permis de confirmer ce mécanisme in vivo. Un premier modèle a été généré par introduction (knock-in) d'une des mutations identifiées dans WNK4 chez les patients atteints de FHHt (p.Asp561Ala) dans le gène WNK4 de la souris. L'abondance protéique de WNK4 augmente dans le rein de ces souris (Wakabayashi et al., 2013), qui présentent tous les signes caractéristiques d'une FHHt (Yang et al., 2007b). L’expression et la phosphorylation de NCC ainsi que la phosphorylation de SPAK augmentent également dans le rein de ces souris. Un deuxième modèle surexprime la protéine WNK4 sauvage grâce à un transgène basé sur un BAC (Chromosome Artificiel de Bactérie) contenant le gène entier. Ces souris présentent l’ensemble des phénotypes associé à la FHHt (Wakabayashi et al., 2013), ce qui prouve que l’accumulation de la forme sauvage de WNK4 est suffisante pour l’apparition d'une FHHt.

Gène Mécanisme Conséquence de la mutation Modifications de l’expression des WNK WNK1 Délétion de l'intron I ↑ transcription de L-WNK1 ↑ L-WNK1 WNK4 Mutation faux sens dans le domaine acide

↑ expression de WNK4 due à des perturbations dans le site de

reconnaissance de KLHL3 ↑ WNK4 WNK4 Mutation R1185C dans le domaine C-terminal

Perturbation d'un mécanisme de régulation impliquant la liaison à la

calmoduline et les sites de phosphorylation SGK1 Non connu KLHL3 Mutations faux- sens dans le domaine BTB ou BACK

Perturbation de l'interaction CUL3- KLHL3

↑ WNK1 ↑ WNK4

KLHL3

Mutations faux- sens dans les hélices kelch

Perturbation de la liaison du substrat (WNK)

↑ WNK1 ↑ WNK4

CUL3 Délétion de l'exon

9

Augmentation de l'ubiquitination et de la dégradation de KLHL3; Altération

de la flexibilité de CUL3 entrainant l'auto-dégradation de CUL3 et empêchant l'ubiquitination des WNK

↓ KLHLγ ↑ WNK1 ↑ WNK4

Tableau 1. Conséquences des mutations FHHt sur l’expression des WNK. ↑ : augmentation, ↓ : diminution. D’après Hadchouel et al., β016.

En conclusion, en conditions normales, le niveau protéique de L-WNK1 et WNK4 dans le DCT est maintenu, entre autres, par dégradation via l’ubiquitination par le complexe ligase KLHL3-CUL3 E3. Les mutations dans le domaine acide de WNK4 et dans les domaines Kelch de KLHL3 interrompent le recrutement de WNK4 et/ou L-WNK1 pour l'ubiquitination. Les mutations dans le domaine BTB ou BACK empêchent la fixation de KLHL3 à CUL3 et donc l'ubiquitination des substrats. La délétion de l’exon 9 de CUL3 cause également une diminution de l’ubiquitination et de la dégradation de L-WNK1 et WNK4. Enfin, la délétion du premier intron de WNK1 stimule la transcription de L-WNK1 dans le DCT et le CNT. De ce fait, les mutations responsables de la FHHt dans quatre gènes différents partagent un mécanisme commun, à savoir une augmentation de l'expression de L-WNK1 et/ou WNK4 (Figure 17). Cependant, et de façon surprenante, les patients porteurs d'une mutation de CUL3 présentent un phénotype plus sévère que les autres (Boyden et al., 2012).

Figure 25. Les mutations responsables de la FHH stimulent l’activité de NCC en augmentant l’abondance des WNK.

Le mécanisme commun à ces mutations est une augmentation de l’abondance des WNK qui entraîne la phosphorylation et l’activation de NCC. Les mutations WNK4 empêchent l’interaction avec KLHLγ, ce qui entraine une diminution de la dégradation protéosomale de WNK4. Les mutations KLHL3 empêchent l’interaction entre KLHLγ et WNK4 et perturbent le complexe ubiquitine ligase Eγ en empêchant l’interaction de KLHL3 avec CUL3. Les mutations CUL3 perturbent l’ubiquitine ligase Eγ et l’activité altérée de CULγ cause vraisemblablement la dégradation du mutant CUL3 lui-même. Cela même également à une diminution de la dégradation protéosomale des WNK. CUL3 sauvage est neddylé mais le degré de neddylation (NEDD8) est moindre comparé au mutant CUL3. Adapté de Ferdaus and McCormick, 2016.