Modulation de l’activité enzymatique de l’ATP synthase par l’Appp

3.1) Introduction

L’ATP synthase compte 6 sites liant les nucléotides, situés au niveau des interfaces entre les chaînes α et β. Les 3 sites situés sur les chaînes β sont les sites catalytiques alors que les sites situés sur les chaînes α sont non-catalytiques. De nombreuses études ont montré que la liaison de nucléotides ou de certaines autres molécules comme le pyrophosphate sur les sites non-catalytiques est capable d’augmenter de façon significative l’activité de l’ATP synthase. De plus, cette activité ne suit pas une loi michaëlienne, les sites catalytiques montrant une forte coopérativité. Selon les études, l’enzyme a été décrite pour posséder 2 voire 3 Km (289). L’ApppI étant capable de se lier de façon stable sur l’ATP synthase, nous avons donc voulu vérifier si cette liaison induisait une modulation de son activité enzymatique. Ceci pourrait

Résultats III : Phosphoantigènes et Ecto-F1-ATPase donner des informations importantes sur les modalités de liaison des phosphoantigènes nucléotidiques à l’Ecto-F1-ATPase. Nous avons donc utilisé deux techniques expérimentales permettant de mesurer cette activité. La première consiste à doser l’ATP à l’aide d’un kit basé sur la mesure de la bioluminescence de la luciférase, dépendante de l’ATP. La seconde correspond à la mesure de l’oxydation du NADH par la méthode dite des enzymes couplées, test classiquement utilisé dans les études de mesure d’activités d’hydrolyse d’ATP.

Nos résultats montrent que l’ApppI est capable de stimuler l’activité ATPasique de la F1- ATPase in vitro et qu’il n’est pas hydrolysé par cette enzyme. Ceci suggère donc qu’il se lie aux sites non-catalytiques.

3.2) Matériel et méthodes

Enzymes et réactifs

La F1-ATPase bovine purifiée (préparation précipitée en sulfate d’ammonium) a été gracieusement fournie par le Pr. J.E. Walker (MRC, Cambridge, Royaume-Uni). Tous les autres réactifs et enzymes proviennent de Sigma Aldrich hormis le kit de dosage de l’ATP (ATP CLSII, Roche).

Dosage d’ATP par bioluminescence

La F1-ATPase a été centrifugée (13000g, 2min) puis solubilisée en tampon d’activité (Hepes 10mM, NaCl 150mM, KCl 5mM, MgCl2 2mM). 250ng d’enzyme ont été utilisés pour chaque mesure. L’ATP (1µM final) ainsi que des concentrations croissantes d’ApppI (volume final : 50µL) ont été incubés avec la F1-ATPase pendant 5min à 37°C, puis 25 µL de solution de luciférase (ATP CLSII) ont été ajoutés. La luminescence a été lue sur un luminomètre Berthold Orion et les données ont été traitées avec Excel.

Résultats III : Phosphoantigènes et Ecto-F1-ATPase

Test des enzymes couplées

La F1-ATPase a été préparée comme décrit précédemment et pour chaque point mesuré 2µg d’enzyme ont été incubés en présence de PhosphoEnolPyruvate (PEP, 250µM), NicotineAmide Dinucléotide (NADH, 250µM), Pyruvate Kinase (PK, 5 unités par point) et Lactate DésHydrogénase (LDH, 1 unité par point), avec ou sans ApppI (100µM) dans un volume final de 200µL en plaques 96 puits à fonds plats. La réaction a été démarrée par l’ajout d’ATP à diverses concentrations et la Densité Optique (DO) mesurée à 340nm (longueur d’onde d’absorption du NADH) pendant deux minutes sur un spectrophotomètre Varioskan Flash (Thermo Corporation). Les données ont été traitées avec Excel.

HPLC

La F1-ATPase a été préparée comme précédemment et incubée (2µg) en présence d’ATP ou d’ApppI (500µM) pendant 15min à 37°C en milieu RPMI. La solution a ensuite été diluée avec de l’eau distillée, injectée sur colonne échangeuse d’anion et analysée comme décrit précédemment (Article 2, p.128).

3.3) Résultats et discussion

L’ajout de quantités croissantes d’ApppI augmente l’activité ATP hydrolase de la F1- ATPase bovine purifiée, de façon dose dépendante, avec une activité plus que doublée pour un ratio ApppI : ATP de 100 (Figure 20A). Le dosage par bioluminescence ne permettant pas de mesurer des quantités importantes d’ATP (la limite étant aux environs de 1-10 µM) et donc d’observer l’effet de l’ApppI en présence de fortes concentrations d’ATP, nous avons utilisé la technique des enzymes couplées. Cette méthode permet de mesurer les activités ATPasiques en temps réel et donc de calculer les vitesses d’hydrolyse. L’ajout d’ApppI

Résultats III : Phosphoantigènes et Ecto-F1-ATPase augmente cette vitesse, mais pour des concentrations faibles d’ATP uniquement (Figure 20B), et cette augmentation tend vers un doublement de l’activité.

Figure 20. Augmentation de l’activité de la F1-ATPase par l’ApppI.

(A) La F1-ATPase (250ng) a été incubée avec des concentrations croissantes d’ApppI et l’activité ATPasique a été déterminée en dosant par bioluminescence l’ATP restant après la réaction (concentration initiale : 1µM). Les résultats sont exprimés en % de l’activité contrôle (sans ApppI) et correspondent aux moyennes de trois puits +/- écart type (représentatif de deux expériences indépendantes). (B) La vitesse d’hydrolyse de l’ATP par la F1-ATPase a été déterminée en présence ou non d’ApppI par la méthode des enzymes couplées. Chaque point correspond à la pente de la droite obtenue par mesure de la décroissance de la DO à 340nm (oxydation du NADH). Encart : Rapport des vitesses d’hydrolyse en présence ou non d’ApppI.

Dans la deuxième méthode utilisée, l’augmentation de la vitesse pourrait s’expliquer par une lente conversion de l’ApppI en ADP par la F1-ATPase. En effet, l’ADP ainsi formé serait régénéré par la PK et donc augmenterait « artificiellement » la vitesse d’oxydation du NADH. Ceci ne permettrait néanmoins pas d’expliquer l’amélioration de l’hydrolyse observée par dosage de l’ATP par bioluminescence. De plus, nous avons pu exclure toute hydrolyse de l’ApppI en ADP par la F1-ATPase en vérifiant par HPLC les nucléotides obtenus (Figure 21). La totalité de l’ATP est hydrolysé en ADP (voir les temps de rétention des tracés des panneaux de gauche), alors que la F1-ATPase n’hydrolyse pas l’ApppI puisque son temps de rétention sur colonne échangeuse d’anions n’est pas modifié.

Résultats III : Phosphoantigènes et Ecto-F1-ATPase

Figure 21. La F1-ATPase

n’hydrolyse pas l’ApppI.

L’ATP et l’ApppI (25nmol) ont été incubés (en bas) ou non (en haut) avec 2µg de F1-ATPase bovine pendant 15min à 37°C en RPMI. Le produit de la réaction a ensuite été dilué et chargé sur colonne échangeuse d’anions. La DO (exprimée en mUA : milliUnités d’Absorption) à 260nm a été acquise.

Bien qu’indirectes, les méthodes que nous avons utilisées dans les expériences précédentes (Article 3, p.143) ainsi que celles décrites ici montrent clairement que l’ApppI est capable de se lier de façon stable à l’ATP synthase. De plus, les résultats obtenus par les études enzymatiques sont plutôt en faveur d’une liaison de l’ApppI aux sites non-catalytiques de l’enzyme. En effet, étant donné que l’ApppI n’est pas hydrolysé par la F1-ATPase, il devrait inhiber l’activité ATPasique s’il se liait aux sites catalytiques. Enfin, sa capacité à augmenter l’hydrolyse d’ATP est équivalente à celle décrite pour le pyrophosphate, qui lie les sites non-catalytiques (289).

En conclusion, l’ApppI nous a permis de démontrer l’implication de l’Ecto-F1-ATPase dans la reconnaissance des phosphoantigènes par les lymphocytes T Vγ9/Vδ2. La stimulation

Résultats III : Phosphoantigènes et Ecto-F1-ATPase de ces lymphocytes par l’ApppI nécessitant sa conversion en IPP, il n’est pas un antigène au sens strict du terme. Néanmoins, les propriétés uniques de l’ApppI (notamment sa capture par les cellules cibles, sa liaison sur l’ATP synthase, et sa production par des cibles classiques les lymphocytes T Vγ9/Vδ2) indiquent que les dérivés nucléotidiques jouent probablement un rôle très important dans le mécanisme global de présentation et de reconnaissance des phosphoantigènes.

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Résultats IV : Métabolisme nucléotidique extracellulaire

1) Introduction

A la surface des cellules, l’ATP et d’autres nucléotides (ADP, UTP et UDP principalement) interviennent dans de nombreux processus cellulaires impliquant notamment les récepteurs purinergiques (P2X et P2Y). Les enzymes participant au métabolisme nucléotidique à la surface des cellules jouent donc un rôle important dans la régulation de ces processus (290). Comme mentionné dans le Chapitre III de l’introduction, l’Ecto-F1-ATPase fait partie de ces enzymes mais ses propriétés enzymatiques sont toujours débattues. L’équipe s’intéresse en particulier à son rôle dans le métabolisme des HDL et la survie des cellules endothéliales. J’ai ainsi été amené à participer à l’étude du métabolisme nucléotidique à la surface des hépatocytes.

Il existe à la surface des cellules plusieurs enzymes de conversion des nucléotides et nous avons cherché à savoir si deux d’entres elles, l’Adenylate Kinase (AK, 2ADP Æ ATP + AMP) et la Nucleoside DiPhosphoKinase (NDPK, qui transfère le phosphate terminal d’un nucléotide triphosphate sur un nucléotide diphosphate), étaient capables de moduler les niveaux d’ADP à la surface des cellules. Nos résultats confirment que l’Ecto-F1-ATPase est dépourvue d’une activité de type ATP synthase. L’AK inhibe constitutivement la voie Ecto- F1-ATPase/P2Y13 en consommant l’ADP et elle est largement responsable de la conversion de l’ADP en ATP à la surface des cellules. Une activité de type NDPK peut être observée mais ne semble pas constitutivement active et ne joue donc probablement pas un rôle majeur dans le métabolisme nucléotidique. De plus, l’Adenosine Nucleotide Translocase (ANT), transporteur d’ADP/ATP associé à l’ATP synthase dans la mitochondrie, est également exprimé à la surface des cellules et intervient dans l’augmentation de la quantité d’ATP extracellulaire en réponse à l’ADP.

Résultats IV : Métabolisme nucléotidique extracellulaire

Résultats IV : Métabolisme nucléotidique extracellulaire