Modifications de la Cas9

3.1 Introduction

Il est possible de muter les régions nucléases HNH ou RUVc. Cela aboutira à un variant de la Cas9 qui ne pourra cliver qu'un seul des deux fragments. Cette activité de clivage monobrin est appelée une activité nickase. Si par contre on mute les deux domaines on obtient une protéine incapable de tout clivage, on la nomme la dCas9 ou

deadCas9 (mutation Asp10 →Ala, His840 →Ala). Cette dCas9 est donc une protéine guidée par ARN et dotée d'une activité de liaison. 5,7

3.2 nCas9 ou Cas9 nickase

Mis à part l'optimisation des gARNs durant leur conception, la spécificité du système CRISPR peut être augmentée par des modifications de la Cas9 elle-même. Les Cas9 nickases se lient à l'ADN basées sur la spécificité de la séquence gARN, mais elles ne génèrent qu'une entaille (nick en anglais) en ne coupant qu'un seul brin au lieu d'une coupure double brin. Ces coupures monobrin sont rapidement réparées par HDR en utilisant le brin complémentaires. Pour générer une coupure double brin, c'est l'utilisation de deux nickases qui sera nécessaire, chacune coupant un brin opposé et créant un brin découpé en quinconce.

Cette technique surnommée double-nick CRISPR permet d'améliorer la spécificité du ciblage.En effet ils est très peu probable que deux coupures monobrins soient à la fois hors-cible et assez proche pour générer une coupure double brin (un peu comme la croyance populaire d'un éclair qui ne peut frapper deux fois au même endroit). Cette technique peut être combinée avec l'HDR pour réaliser des éditions génomiques de manière très spécifique113–115

fig.28 Représentation schématique du fonctionnement de la Cas9, de Cas9 nickases et du système double nickase86

3.3 dCas9 ou dead Cas9 : Crispr Interference

L'une des faculté clef de las Cas9 est sa capacité à se lier spécifiquement aux acides nucléiques lorsqu'elle est guidée par son ARN. Dépourvue d'activité nucléase la dCas9 peut être utilisée pour des expériences de régulation génique par interférence à l'échelle du génome entier. Ce processus est nommé CRISPRi pour Crispr Interference. En fonction du site reconnu par le complexe dCas9-ARN guide cette stratégie permettra par exemple de bloquer la phase d'élongation pendant la transcription ou encore de bloquer la liaison de facteurs de transcription. Un des intérêts majeurs de CRISPRi est son utilisation pour réprimer plusieurs gènes simultanément et le fait que la technique soit réversible. Cette technique offre une alternative intéressante à l'ARNi, notamment grâce à l'absence de système CRISPR chez les eucaryotes, évitant toute compétition avec des processus endogènes.

3.4 dCas9 Fusion

La possibilité de cibler une séquence via la dCas9 et de s'en servir comme plateforme pour emmener une protéine au contact de l'ADN cible permet de nombreuses possibilités voici quelques exemples qui seront détaillés par la suite :

fig.29 Illustration des construction basée sur la création de dCas9 chimériques

À gauche la fusion avec des effecteurs permet la régulation génétique et épigénétique. Au centre la fusion avec la GFP permet le marquage dynamique et in vivo de l'ADN. À droite une construction permettant le contrôle de son activité. Ce contrôle se fait via la reconstitution d'une cas9 préalablement scindée dont chaque lobe porte une protéine

3.4.1 dCas9 Fusion régulatrice

En générant des versions chimériques de la dCas9 qui sont fusionnées à des domaines de régulation, il est possible d'utiliser la technique CRISPRi pour réaliser de la régulation d'expression génique au sein de cellules de mammifères. Par exemple la fusion dCas9 aux domaines VP64 ou KRAB transforme cette protéine en régulateur transcriptionnel et permet respectivement de déclencher (on parle alors de CRISPRa ou CRISPR activation) ou de réprimer la transcription dans des cellules humaines.La fusion avec des acyltransferases et des déméthylases permettrait de générer des modifications épigenetiques116,117.

3.4.2 dCas9 Fusion en imagerie

Lorsqu'elle est fusionnée à un fluorophore, la dcas9 devient un outil de visualisation spécifique des séquences d'ADN et permet une visualisation dynamique de la chromatine 118. C'est le travail qu'a réalisé une équipe de l'Université de Californie 118. Pour savoir si les techniques CRISPR et PNA FISH ( Peptide nucleic acid Fluorescent in situ hybridization, une variante du Quantitative FISH ou Q FISH) sont aussi efficaces l'une que l'autre ils les ont utilisées pour mesurer la longueur des télomères. En analysant le median telomere puncta intensity, c'est à dire l'intensité lumineuse médiane produite par chaque point (donc chaque télomère rendu fluorescents) ils ont été capable d'apprécier leur longueur. En comparant la fluorescence de deux lignées cellulaires, les cellules RPE (Retinal pigment epithelium) et les cellules UMUC3, lignée de cellules cancéreuses de vessie humaine, ils observent un taux médian d’intensité lumineuse environ 3 fois supérieur pour les cellules RPE quelque soit la méthode de marquage utilisée. De plus le nombre de télomères calculés est retrouvé identique qu'importe la méthode. La corrélation entre ces mesures suggère que l'imagerie par CRISPR permet d'obtenir des résultats comparable à celle par PNA FISH. Par contre elle possède un avantage immense : elle peut être utilisée sur des cellules vivantes.

fig.30 L'imagerie par CRISPR permet de détecter la longueur des télomères : Comparaison de la longueur des télomères des cellules RPE et UMUC3 en utilisant l'imagerie par CRISPR (en haut) ou PNA FISH (en bas). Le diagramme à point montre l'intensité de chaque télomères identifiés sur une échelle logarithmique. En bleu pour RPE et violet pour UMUC3.

Cet outil d'imagerie via CRISPR a le potentiel d'améliorer les techniques antérieures pour étudier les réarrangements dynamiques des chromosomes dans leur état natif, au cœur des cellules vivantes. Des applications d'imageries multicolores peuvent même être créées en utilisant plusieurs dCAS9 distinctes. Par exemple il est désormais possible de visualiser simultanément jusqu'à 6 loci en utilisant la technique appelée CRISPR rainbow119.

3.5 dcas9 fusion et purification des acides nucléiques

En se basant sur le concept de chIP (chromatin ImmunoPrecipitation), les chercheurs ont développé le enChIP (pour engineered DNA binding molecule-mediated chIP) qui permet de purifier une séquence génomique spécifique en la ciblant par ARNg. Une dCas9 inactive fusionnée à une étiquette épitope (une courte séquence peptidique pour laquelle on possède un anticorps capable de s'y lier avec une grande affinité) peut être utilisée pour purifier l'ADN lié au gARN 124.

3.6 Split Cas9

La Cas9 a une structure bilobée, cela peut s'avérer être une propriété intéressante pour contrôler son activité à l'intérieur même des cellules. En la découpant, en deux sous-unité, on sépare les deux lobes. On peut alors contrôler son ré-assemblage en utilisant des domaines hétéro-dimères inductibles qui agirons alors comme des bandes velcro inductibles. La dimérisation de ces hétéro-dimères peut être déclenchée chimiquement par des petites molécules ( pour les domaines ABI/PYL) ou encore par certaines longueur d'onde ( domaines CIB1/CRY2).121,122Ils permettent une régulation spatiale et temporelle de l'activité Cas9 qui peut se révéler utile en clinique pour faciliter le contrôle de l'activité systémique de la Cas9.