Mise en évidence d’une régulation différente de l’initiation de la transcription

Outre le profil particulier d’UBF, je pense que cette thèse a mis en évidence un aspect mécanistique intéressant de la transcription ribosomique à travers les profils de ChIP-seq de PolI et de Rrn3. Tout d’abord le profil de PolI confirme une présence égale le long de la région transcrite des gènes d’ARNr. Cette observation suggère que l’ARN Polymérase I n’est pas sujette à une régulation particulière lors de l’étape d’initiation comme ça peut être le cas pour PolII. En corrélation avec cette observation, le profil de Rrn3 présente une caractéristique intéressante (figure 3.1). La pente qu’il exhibe au niveau du début du gène suggère que sa présence diminue de façon stochastique. Ce facteur est responsable du

PolI recruté au promoteur, la transcription débute sans délai observable et cet évènement corrèle avec une déstabilisation de l’interaction entre PolI et Rrn3.

Les cellules souches embryonnaires apportent de nouvelles informations. En effet, PolI et Rrn3 présentent des différences de profil intéressantes avec ceux observé dans les MEFs. PolI présente un pic clair au niveau du promoteur en amont du SIT. Ce pic est également corrélé avec un pic de Rrn3 qui n’a donc pas le signal de relargage stochastique. On peut remarquer cependant que la position de ces pics de PolI et Rrn3 pourraient être masqué dans le cas des MEFs. Le pic de PolI pourrait donc être expliqué par un plus petit signal de PolI au niveau de la région transcrite comparativement au promoteur. Cette hypothèse est supportée par l’étude de la vitesse de la transcription ainsi que des traitements avec l’inhibiteur de l’initiation de la transcription CX-5461 (partie 4.3.4). Dans cette étude nous avons démontré que l’inhibition de l’initiation de la transcription menait à l’obtention d’un signal sous forme de pic pour PolI et Rrn3 au niveau du promoteur principal dans des cellules fibroblastiques. Ce signal correspond à la position attendu du CPI et également à celle du pic des cellules mESCs. Couplé à la constatation que la vitesse d’élongation est la même dans les deux types cellulaires, cette étude met en avant que les cellules mESCs et fibroblastiques possèdent des modes de régulations différentes. Une corrélation avec le nombre de gènes actifs dans ces différents types cellulaires permet d’étayer cette hypothèse.

Une manière de confirmer les conclusions du chapitre 4 serait de réaliser la technique d’étalement de Miller&Beatty (O. L. Miller and Beatty 1969) sur des cellules souches embryonnaires. L’étude des modifications de la transcription ribosomique au cours de la différentiation cellulaire que celles utilisées dans cette thèse est également un axe intéressant pour comprendre les mécanismes de régulations qui lui sont associés.

H) Le nombre de gènes d’ARNr transcrits est corrélé à

la différentiation cellulaire

Dans le chapitre 4, les cellules fibroblastiques ou embryonnaires exhibent différentes quantités de gènes actifs. La vitesse d’élongation ne varie cependant

pas entre ces lignées. Étant donné les résultats suggérant les variations rapides de ce paramètre cellulaire, il est possible qu’il serve principalement en cas de nécessité d’activation rapide de la transcription uniquement. D’après les paramètres calculés, c’est la quantité de gènes actifs qui différent entre ces lignées cellulaires. Une hypothèse est que si le nombre de gènes actifs ne reflète pas réellement la production des ARNr (Sanij et al. 2008). Il semblerait qu’il reflète davantage l'état de différentiation des cellules.

Les cellules ESCs possèdent très peu de méthylation sur l’ADNr et la majorité des gènes sont transcrits. Les cellules fibroblastiques possèdent une partie de leur ADNr méthylée et seule une petite fraction (30%) des gènes non méthylés sont transcrits. La différence majeure entre ces deux cellules est la portion de gènes qui sont accessibles au psoralène, à la DNaseI, recouverts par UBF et transcrits efficacement. La chromatine ouverte est plus sensible aux dommages à l’ADN et donc dans le cas ou seule une partie des gènes ribosomique est transcrite, la cellule protège un maximum son intégrité en utilisant au maximum une petite partie de l’ADNr. Cette portion de l’ADNr se retrouve au sein du nucléole qui est lui-même un senseur de stress de la cellule (Revue dans : Tsekrekou, Stratigi, and Chatzinikolaou 2017). L’une des conséquences de cette fonction est que les dommages à l’ADN au niveau des gènes ribosomiques induisent un arrêt immédiat de la prolifération cellulaire.

Dans le cas des cellules mESCs, tous les gènes sont dans une configuration ouverte. Cette situation ne semble pas optimale pour la croissance cellulaire et aurait donc un rôle à part entière. Une hypothèse serait que la cellule se sert de l’ADNr lui-même comme senseur de stress. Les cellules ES possèdent des mécanismes de réparations de l'ADN très actifs (Revue dans : Vitale et al. 2017). En gardant accessible l’ADNr, la cellule augmente sa sensibilité aux dommages à l’ADN. Pour qu’une cellule viable ce développe elle se doit de conserver intact son ADNr et donc la performance des systèmes de réparations devient primordiale. D’un côté si les dommages sont trop importants la cellule ne pourra plus se développer puisqu’incapable de synthétiser de nouveaux ribosomes, ce qui pourrait être un mécanisme de senseur de l’environnement. D’un autre côté

si le système de réparation n’est pas assez performant il contre-sélectionnera les cellules concernées, ce qui serait un gage de qualité de la cellule.

I) La transcription des gènes ribosomiques permet

l’ouverture de la chromatine

En utilisant la totalité de son ADNr comme senseur de stress, la cellule crée une situation où tous les gènes sont ouverts et transcrits. Dans ce cadre, la détermination de la présence des FGTs sur chaque répétition nous apporte de nouveaux éléments. Un aspect intéressant apporté par l’étude dans les cellules souches embryonnaires concerne une comparaison entre les deux promoteurs de l’ADNr. Comme discuté dans le chapitre 4, si l’on considère maintenant la hauteur similaire de pics de SL-1 ou d’UBF entre le promoteur principal et le SpPr dans des cellules fibroblastiques, on peut émettre l’hypothèse que ce profil représente spécifiquement les gènes actifs. Dans les cellules mESCs en revanche, on sait que tous les gènes ribosomiques sont ouverts et transcrits, ils montrent une différence de profil les pics de SL-1 ou d’UBF au niveau des deux promoteurs. Cette nouvelle donnée tend à infirmer cette hypothèse, elle suggère plutôt que cette différence reflète le niveau d’activation du promoteur principal.

Une hypothèse concernant la régulation de la transcription des gènes ribosomiques serait donc que la présence du CPI au niveau du SpPr détermine si un gène doit ou non être transcrit in vivo. Les signaux observés au niveau du promoteur reflètent ainsi la densité de transcription du gène. En conclusion, même si UBF est suffisant pour maintenir l’état stable de la chromatine ouverte en cas de perte de la transcription (figure 3.2), il est présent uniquement sur les gènes transcrits. Cette observation suggère donc que c’est la transcription qui est responsable de la présence d’une forme de l’ADNr lié par UBF et ouvert.

Un aspect que je n’ai fait qu’effleurer à mon grand damne le long de cette thèse de doctorat est le rôle du SpPr dans un contexte cellulaire. Il est plutôt évident que durant mes études j’ai mis en évidence une importance grandissante de cette région particulière dans les hypothèses de la régulation de la transcription ribosomique en particularité avec la mise en évidence de la barrière nucléosomique. Une perspective intéressante que j’ai commencé à envisager et

développer serait sur l’utilisation du système CRISPR/Cas9 dans l’étude de cette zone. Des études préliminaires ont permis de réaliser un ChIP dirigé spécifiquement contre la protéine Cas9 étiqueté avec le Flag. Ces résultats suggèrent qu’il est possible par ce système de cibler de différentes façon cette zone. Par exemple, une fusion de la deadCas9 (Cas9 modifiée pour être non processive permettant ainsi de cibler mais sans endommager l’ADN) avec des enzymes permettant la modification des histones permettrait d’étudier le rôle in vivo de la barrière nucléosomale identifiée. Une deuxième approche serait de cibler une Cas9 processive pour induire des dommages à l’ADN au niveau du SpPr précisément. Suite à ces dommages le positionnement ainsi que la localisation cellulaire des FGTs pourrait être étudiée. Dans ces circonstances la détermination du nombre de polymérase par gène pourrait être un bon moyen d’étudier l’effet in vivo de ces modifications.

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