Chapitre 4 : Caractérisation de la transcription ribosomique dans des cellules
4.3. Résultats
4.3.1. Les gènes ribosomiques dans les Cellules ES sont d'avantage sous conformation actives
d'avantage sous conformation actives que dans des
cellules fibroblastiques
L'une des différences les plus évidentes entre cellules ES et cellules différenciées a été identifiée grâce au séquençage après modification au Bisulfite (Whole Genome Bisulfit Sequencing: WGBS). Cette technique est utilisée pour déterminer le niveau de méthylation des sites CpG au niveau de l'ADN; la figure 4.1A présente spécifiquement les résultats pour les gènes codant les ARNr. Globalement, la lignée de cellule embryonnaire E14 possède moins de méthylation au niveau des sites CpG que les cellules de type fibroblastes. On constate d'une part une plus grande densité de sites de méthylation sur le gène (3336) que sur la région inter-génique (262) et d'autre part un niveau plus haut de méthylation sur la région inter-génique que sur le gène (tableau 1). Une quantification moyenne de la méthylation des différentes régions est présentée dans le tableau 1.
Figure 4-1 : Alignement du séquençage après traitement au bisulfite sur le gène
de l'ARN ribosomique. L'échelle verticale représente le pourcentage de méthylation pour chaque site CpG dans les cellules NIH3T3, MEF et E14. A Vue globale du profil de méthylation sur l’ADNr. B Agrandissement du site de méthylation CpG-133 situé en amont du site d'initiation de la transcription.
Des différences de méthylation sont également visibles entre les deux lignées fibroblastiques. Les régions géniques des MEFs possèdent 16.2 % de chaque site méthylé en moyenne là où le niveau de méthylation dans les NIH3T3 est de 34.78%. Il a été suggéré que la méthylation d'un site CpG à la position -133 (à partir du site d'initiation de la transcription) est suffisante pour empêcher la transcription du gène d'ARNr correspondant (Santoro and Grummt 2001, 2005). Comme mis en exergue dans la figure 4.1B, il n'y a apparemment pas de différence entre le niveau de méthylation de ce site et celui des sites adjacents. Cette observation suggère qu'il n'y a pas de raison particulière de considérer ce site comme déterminant dans l'état d'activation des gènes codant les ARNr mais que c'est la totalité de la méthylation qui serait à l'origine de l'extinction génique in vivo.
Si l’on considère le niveau de méthylation de la région génique, on observe des pourcentages de méthylation respectivement de 34,78% et de 16,2% pour les NIH3T3 et les MEFs et seulement de 1.24% pour les cellules E14. La méthylation des promoteurs des gènes de manière générale est majoritairement reliée à l'inactivité de ces derniers et également à une forme compactée de l'ADN (Fouse et al. 2008). D’après le résultat de WGBS la situation dans les cellules souches embryonnaires E14 est une situation où tous les gènes codant les ARNr seraient dans une conformation active et largement non compactés.
A B 28S 18S 5.8S T0/Prom SpPr/Tsp Ter % methylation (0-100) NIH3T3 MEFs E14 % meth yla tion (0-50) ADNr
Tableau 1 : Pourcentage de méthylation moyen des sites CpG de l'ADNr au niveau
des séquences inter-géniques (SIG) ou géniques.
Type cellulaire SIG (0-11808 and 28926- 45341) 262 sites Région génique (11809- 28925) 3336 sites NIH3T3 60.47 % 34.78 % MEFs 72.73 % 16.2 % E14 30.22 % 1.24 %
Bien que le niveau de méthylation des gènes soit un bon indice pour comprendre l'état d'activation de notre population de gènes, il n'indique en rien que les gènes non-méthylés sont tous transcrits. Afin de déterminer si cet état non-méthylé est corrélé avec une forme ouverte de la chromatine, nous avons réalisé des expériences d'accessibilité au psoralène sur les lignées de cellules E14 et NIH3T3. Dans cette expérience le psoralène est incorporé dans l'ADN des cellules, plus l'ADN est accessible, plus le psoralène pourra être incorporé; une fois incorporé, l'ADN est extrait et digéré par des enzymes de restriction pour être analysé par southern-blot. La migration d'un fragment d'ADN changera suivant la quantité de psoralène incorporé, plus le psoralène sera incorporé et plus la bande sera retardée (Toussaint et al. 2005; Conconi et al. 1989). Comme montre la figure 4.2A, la bande de migration supérieure (retardée) dans les cellules E14 est plus importante que dans les cellules NIH3T3 montrant que la majorité des gènes sont dans une conformation ouverte.
Pour permettre de corréler la méthylation de l'ADNr avec l'état d'accessibilité de la chromatine, nous avons quantifié la bande de migration supérieure. Dans les cellules E14, cette bande représente 91% du signal de Southern-blot. Si l'on corrèle ces résultats à ceux du WGBS on observe qu'environ 9% des gènes identifiés comme non méthylés dans les cellules souches embryonnaires sont peu accessibles au psoralène.
Figure 4-2 : Les cellules ES montrent une forte incorporation au psoralène
dépendamment de la présence d’UBF. A. Incorporation de Psoralène dans des cellules NIH3T3 par rapport aux cellules E14 (ctrl : pas de traitement au psoralène, même membrane, différente localisation). B. Analyse par Western blot de la perte d'UBF après induction de la délétion du gène dans des cellules embryonnaire de souris. C. Incorporation de psoralène dans des cellules ES de souris durant la déplétion d’UBF. En vert la bande correspondant à une forte incorporation et en rouge la bande correspondant à une faible incorporation de psoralène.
Dans les cellules NIH3T3 la bande de migration supérieure ne représente que 29% du signal total, il y a donc une différence de l'ordre de 36% entre les gènes méthylés et ceux non-accessibles (35% méthylation, 71% de gènes non- accessibles au psoralène). Dans le chapitre 3 de cette thèse, nous avons montré que, lors des expériences d’incorporation au psoralène, la bande de migration supérieure de l'ADNr dépendait de la présence d'UBF dans des MEFs (Herdman et al. 2017). Dans les cellules E14, il est possible que tout l’ADNr soit dans une configuration ouverte dépendamment de la présence d'UBF. Pour confirmer cette hypothèse nous avons utilisé une lignée de cellules souches embryonnaires conditionnelles pour la délétion d'UBF (mESCells ERCre+/+ UBFflox/flox) sous
contrôle de la Cre-recombinase fusionnée avec le récepteur aux estrogènes. Une deuxième lignée ne possédant pas de site loxP dans son génome a également été utilisée pour permettre de contrôler l'effet de la Cre-recombinase dans nos expériences. L'accessibilité au psoralène a été réalisée avec ces cellules. Dans ces lignées le pourcentage de gènes accessible au psoralène est de l’ordre de 75% montrant que ces lignées embryonnaires possèdent également majoritairement la bande de migration supérieure (ligne verte figure 4.2C, quantification Tableau 2).
A
Ctrl NIH3T3Mélange E14
C
0 24 48 72
flox/flox cre++ WT/WT cre++
Haute Faible Ctrl 0 24 48 72 Heures post 4-HT Incorporation 0 24 48 72 1 1/10 1/100
mESCflox/floxcre+/+ Heures post-traitement Quantité d’échantillon α-UBF α-Tub
B
Haute FaibleTableau 2 : Quantification des deux bandes de migration après traitement au
psoralène après induction de la Cre-recombinase dans des cellules ES.
mES UBFfl/fl ERCre+/+ mES ERCre +/+
Heures après traitement 0 24 48 72 0 24 48 72
Haute (%) 72 48 20 7 76 77 73 76
Basse (%) 28 52 80 93 24 23 27 24 Après induction de la délétion du gène codant pour UBF dans ces lignées et la perte de plus de 90% de la protéine (figure 4.2B), une diminution du retard est observée au cours de la déplétion d’UBF pour finalement représenter moins de 10% du signal dans la bande supérieure de migration (ligne rouge figure 4.2C; quantification tableau 2). La perte d’UBF entraine la perte d’accessibilité au psoralène. Les cellules souches embryonnaires présentent majoritairement leurs gènes ribosomiques dans une conformation accessibles au psoralène et non méthylés et ce de façon dépendante de la présence d'UBF.
L'une des questions majeures au sujet de la conformation de l'ADNr actif porte sur la présence ou non de nucléosomes au niveau des gènes transcrits. Précédemment, nous avions suggéré que l'ADNr actif était dépourvu de nucléosomes. En guise de support, nous avions relié la perte d’UBF avec une formation de chromatine nucléosomique sur les gènes codant les ARNr. Ces travaux suggèrent que les gènes ouverts étaient couverts par UBF qui remplaçait les nucléosomes sans pour autant démontrer que cette situation était spécifique aux gènes actifs. Afin de régler cette question, nous avons effectué une expérience de digestion à la MNase dans les cellules mESCells ERCre+/+ UBFwt/wt ou
UBFflox/flox 72h après l'induction de la déplétion d'UBF. Ces résultats, présentés
sur la figure 4.3A, montrent une absence de nucléosomes le long de la région transcrite de l'ADN ribosomique. Cependant, 72 heures après l’induction de la déplétion d'UBF, une échelle nucléosomique apparait lors l’expérience de la digestion à la MNase. Cette expérience montre que la formation de nucléosomes le long des gènes actifs codant l’ARNr est rendue possible par la perte d’UBF sur les gènes actifs plus spécifiquement. En complément, une expérience de digestion à la DNaseI suivit de séquençage à haut débit avait permis de montrer que l’ADNr était une zone sans nucléosome dépendamment de la présence d’UBF. Cette enzyme clive l'ADN de manière simple brin spécifiquement en fonction de son
accessibilité. Cette caractéristique a été utilisée afin d'étudier des zones de l'ADN déplétée en nucléosomes qui, étant plus sensibles, peuvent être clivées sur chaque brin et relâcher ainsi dans la réaction des petits fragments. Les fragments de petite taille (entre 50 et 300 pairs de bases) sont ensuite sélectionnés puis séquencés.
Figure 4-3 : L’accessibilité de l’ADN dans les cellules ES est dépendant de la
présence d’UBF est de l’absence de nucléosomes. A. Digestion à la MNase de l’ADN après induction de la déplétion d’UBF dans des cellules ES. L’encadré montre la sonde radioactive utilisée. B. Séquençage après digestion à la DNaseI de cellules mESCs UBFflox/flox ERCre+/+ non induite. Les résultats sont présentés pour l’ADNr uniquement.
Dans le cas des cellules souches embryonnaires, cette technique devrait refléter uniquement les gènes ouverts, sans nucléosomes. Les résultats de l'alignement sont présentés à la figure 4.3B. À l’instar des cellules de type fibroblastes, les cellules souches embryonnaires possèdent leur ADNr accessible à la DNaseI. Ce résultat montre, combiné aux autres études structurelles et de méthylation, que l’ADNr actif est non-nucléosomique et ouvert dépendamment
Southern min MNAse 5 10Sans UBF 15 20 30 5 10Avec UBF15 20 30
EtBr 5 10 15 20 30 5 10 15 20 30
A
18S 5.8S 28S ETS (EcoRI/ EcoRI Mr100probe 5646-12251) Sondes Radioactive
B
28S 18S 5.8S T0/Prom SpPr/Tsp Ter Digestion DNaseI enrichissement relatif 20 0de la présence d’UBF. Confirmant ainsi que la présence d’UBF est compatible avec une forme ouverte de l’ADN.