La localisation des Facteurs Généraux de Transcriptions (FGTs) au SpPr suggère un rôle de

(FGTs) au SpPr suggère un rôle de cette zone dans la

détermination de l'état d'activité des gènes codant

l'ARNr

Nous avons effectué des expériences de ChIP-seq avec des anticorps dirigés contre les FGTs de la transcription ribosomique UBF, rpa194 (PolI), Rrn3, TTF-1 et TAF68 (SL-1) dans des cellules E14 en culture. Les résultats de l'alignement le long de l'ADNr après normalisation sont reportés en figure 4.6. Globalement le profil de ChIP-seq des FTGs est similaire avec ce que nous avons observé dans les MEFs pour UBF, SL-1 et TTF-1 (Herdman et al. 2017). En conséquence, je ne m’attarderai ici que sur les différences majeures. En comparant les données générées dans les cellules E14 avec celles générées dans les MEFs. Une différence a été remarquée au niveau des signaux de SL-1 et UBF entre les cellules souches embryonnaires et fibroblastiques. Dans les MEFs, les signaux entre le Prom et le SpPr étaient similaires.

Figure 4-6 : ChIP-seq des protéines UBF (bleu), TAF68 (jaune), TTF-1 (rouge), PolI

(vert foncé) et Rrn3 (vert clair) dans des cellules E14. Seuls les régions génique et promotrice de l’ADNr sont présentés.

En revanche, dans les cellules souches embryonnaires, le signal au SpPr est systématiquement plus important. Afin de quantifier ces différences, nous avons calculé le rapport des signaux d'enrichissement relatif maximum pour UBF et TAF68 dans les jeux de données MEFs ou cellules mES et E14 (reportés dans le tableau 3).

Tableau 3 : Mesure des ratios des signaux maximums des ChIP seq d'UBF et

TAF68 entre le promoteur principal (Prom) et le Spacer Promotes (SpPr). Moyenne de toutes les données MEFs et lignées de cellules souches embryonnaires (n= nombres de réplicats) Ratio UBF_MEFs (n=7) TAF68_Mefs (n=3) UBF_ES (n=4) TAF68_ES (n=3) Prom/SpPr 1.25 1.25 0.72 0.51 Déviation 0.26 0.1 0.07 0.066

On observe dans les MEFs, une situation où le signal maximal d’UBF et SL-1 au SpPr est 1.25 fois plus faible qu'au promoteur principal. Dans les cellules souches embryonnaires, la tendance est inversée avec jusqu'à deux fois plus de

signal pour SL-1 au SpPr qu'au promoteur principal. D'un côté, comme nous savons que tout l'ADNr a une conformation non-nucléosomale ouverte dans les cellules souches embryonnaires. La forte présence de SL-1 et d'UBF au SpPr semble corréler avec une situation où tous les gènes sont actifs. Dans les MEFs, ce signal représente potentiellement tous les gènes actifs. La différence entre les lignées cellulaire se fait donc au niveau de l'occupation du promoteur principal par SL-1 et UBF. Dans le cas où deux populations géniques actives coexisteraient dans les cellules souches embryonnaires. L'une d'entre elles posséderait UBF et SL-1 au niveau de son promoteur principal (population active transcrite) et l'autre non (population ouverte non-transcrite). Une deuxième hypothèse voudrait qu’il n'existe qu'une seule population, l'occupation du promoteur principal par SL-1 et UBF plus faible qu'au SpPr pourrait corréler avec une situation où tous les gènes sont transcrits mais où le niveau de transcription des gènes est différent que dans la situation précédente. L’observation des signaux de Rrn3 et PolI semble aller dans le sens de la deuxième hypothèse. En effet, malgré les similitudes, nous avons observé une différence surprenante entre les MEFs et les cellules E14 pour PolI et Rrn3. Comme on peut le voir sur la figure 4.7, les signaux de PolI et Rrn3 dans la région du SpPr sont sous forme de pics uniques clairement définis et à peu près superposables dans les deux lignées cellulaires. En revanche, au niveau du promoteur, cette représentation suggère que la situation de la transcription elle-même est plus faible dans les cellules ES que dans les MEFs. En effet, au promoteur principal des cellules ES, nous avons identifié un pic unique pour PolI centré juste quelques bases en amont du SIT (ligne rouge figure 4.7). Ce pic n'est pas visible dans les données obtenues à partir des MEFs mais il corrèle parfaitement avec le pic de Rrn3 visible dans cette lignée. Il se peut cependant qu'il soit caché dans le signal qui s'étend le long de la région transcrite dans les MEFs. Reflétant les changements de PolI au promoteur principal, Rrn3 est présent sous la forme d'un seul pic. Auparavant nous avons suggéré un relargage stochastique de Rrn3 par PolI après initiation dans les MEF (Chapitre 3). Pour les cellules ES, nous observons un profil superposé de Rrn3 et PolI centré juste en amont du SIT suggérant que l'endroit où ce complexe est le plus abondant est également le lieu de recrutement de PolI.

Figure 4-7 : Comparaison du ChIP-seq de PolI et de Rrn3 entre des cellules mESs

(ligne noire) et des MEFs (Histogramme vert). La barre rouge représente le site d'initiation de la transcription. Seules les régions des promoteurs et le début du gène est représentée.

Ce résultat suggère soit une régulation différente au niveau de l'initiation dépendante entre les deux lignées cellulaires soit une vitesse d'élongation de la transcription plus faible qui modifierait le profil de relargage stochastique de Rrn3 observé dans le chapitre 3 figure1B.

Pour tester ces hypothèses, nous nous sommes basés sur des travaux précédents du laboratoire qui avaient démontré que ce sont les variations de la vitesse d'élongation qui permettent de réguler la transcription des gènes codant l'ARNr dans les cellules NIH3T3 plutôt qu’une limitation de l'initiation (V. Stefanovsky et al. 2006). Afin de voir si le profil observé dans les cellules ES reflète un changement dans la vitesse d'élongation, nous avons effectué des expériences de ChIP-seq des protéines PolI et Rrn3 dans des cellules NIH3T3 dans les conditions expérimentales de cet article de recherche. Ces expériences avaient permis de mettre en évidence une élongation 5 fois plus importante en présence de sérum qu’en présence de l'inhibiteur de ERK PD98057 sans aucune variation mesurable du niveau de Pol. Étant donné que les MEFs et les NIH3T3 possèdent les mêmes morphologies de signaux pour les ChIP-seq et que les expériences concernant la vitesse d'élongation ont été réalisées dans cette lignée, nous avons préféré utiliser des cellules NIH3T3 pour la suite des expérimentations. Une

expérience de ChIP-seq a été réalisées dans ces conditions, les résultats sont reportés sur la figure 4.8. Aucune variation morphologique des signaux PolI et Rrn3 n’a été observée suite aux différents traitements. Contrairement à la publication d’origine, nous avons constaté une différence au niveau de l'intensité des signaux qui se voit légèrement plus élevée après addition du sérum. On observe que les changements dans la vitesse d'élongation n'ont pas d'impact sur le profil des immuno-précipitations. Bien que surprenant, ce résultat permet également de confirmer que le stress nutritif n’a pas d’impact sur la présence de PolI sur l’ADNr.

Figure 4-8 : ChIP-seq de PolI ou Rrn3 dans des cellules NIH3T3 en présence de

sérum (histogramme vert) ou en présence de PD98057 50µM (ligne noire). Ces données ont été normalisées à partir des résultats de qPCR obtenus lors de l'expérience.

Ce résultat suggère principalement que la différence de profil observé entre les cellules de types embryonnaires et fibroblastiques n’est pas au niveau de la vitesse d’élongation de la transcription.

Pour permettre d'étudier directement l'étape d'initiation, nous avons décidé d'utiliser un inhibiteur de cette étape de la transcription ribosomique. Le CX-5461 est une molécule découverte récemment. Elle est soupçonnée de cibler l'initiation de la transcription de l'ARNr en empêchant le recrutement de SL-1 au niveau des promoteurs des gènes d'ARNr (Drygin et al. 2011). Après avoir vérifié l'inhibition de la production d'ARN ribosomique suite au traitement par le CX- 5461 sur nos lignées cellulaires (Figure 4.9A), nous avons traité des cellules NIH3T3 avec 10µM de C-X5461 pendant 15 minutes, à la fin du traitement les cellules ont été fixées puis récoltées.

Figure 4-9 : Effet du CX-5461 sur la transcription et la localisation des FGTs dans

des cellules NIH3T3. A. Marquage métabolique avant et après traitement au CX- 5461 (échelle horizontale : C traitement 10uM avec du CX-5461, H marquage métabolique avec de l'uridine radio-marquée avec 3_{H, R récolte des échantillons).}

B. ChIP-qPCR d'UBF, Rrn3, PolI et TAF68 en condition contrôle (bleu), traités 15min

avec 10µM de CX-5461 (vert). L'encadré présente un schéma de l'ADNr, les petites flèches noires représentent les zones amplifiées par qPCR.

L'expérience de ChIP-qPCR a montré des diminutions de la présence de SL-1 ou d'UBF après 15 minutes de traitement au niveau du promoteur principal ainsi que du SpPr (Figure 4.9B). Lors de cette expérience une diminution de PolI

47S

28S

Non traitées30min CX-5461

A B % Immunoprécipitation 28S 18S 5.8S T0/Prom SpPr/Tsp Ter IGS3 SpPr Tsp Prom 47S ETS 28S Ter Amorces C H R 30min 30min 0 1.75 3.50 5.25 7.00 UBF 0 0.75 1.50 2.25 3.00

IGS3 SpPr Tsp Prom 47S ETS 28S Ter

PolI 0 0.5 1.0 1.5 2.0 Rrn3 0 1.25 2.50 3.75 5.00 TAF68

IGS3 SpPr Tsp Prom 47S ETS 28S Ter

Non traitées CX-5461

ainsi que des variations surprenantes du signal de Rrn3 ont également été observées. Étant donné la corrélation avec les données précédemment publiées, nous avons choisis de nous intéresser plus spécifiquement aux changements observés pour Rrn3 qui montraient une augmentation de son signal spécifiquement au niveau des deux promoteurs et une diminution au niveau du début de la région transcrite.

Figure 4-10 : ChIP-seq de PolI et Rrn3 dans des conditions contrôles (histogramme

vert) ou traité avec 10uM de CX-5461 (Ligne noire). Le panneau supérieur présente les résultats pour PolI et le panneau inférieur pour Rrn3.La ligne rouge représente le SIT.

Afin d'étudier cet effet plus en détails, une expérience de ChIP-seq a été réalisée contre les protéines PolI et Rrn3. Afin de faciliter la compréhension des résultats, la hauteur des signaux de séquençage a été normalisée avec les résultats de qPCR. L’image résultante permet ainsi de se faire une idée de la forme (séquençage) et de la quantification (qPCR) des différentes expériences. Les résultats reportés sur la figure 4.10 montrent une légère diminution du signal de

PolI au niveau du SpPr. Pour Rrn3 on observe une forte augmentation du signal au SpPr après traitement au CX-5461.

Au niveau du promoteur, plusieurs changements arrivent de manière flagrante. Le premier est la perte de PolI au niveau de la région transcrite qui corrèle avec la perte de la transcription mais également avec la perte de Rrn3 sur le début de la région transcrite. Les deux signaux se superposent juste en amont du SIT. Dans cette expérience, le CX-5461 inhibe la transcription ribosomique en empêchant la séparation de Rrn3 et de PolI. Deuxièmement, nous avions précédemment fait l’hypothèse que PolI au niveau du SpPr était dans un état d'élongation. Ici, nous montrons qu’en inhibant l’initiation de la transcription, le signal de PolI ne varie pas beaucoup, en revanche celui de Rrn3 augmente suggérant ainsi que le roulement de Rrn3 est empêché et que donc les PolI présentes à cet endroit restent à la même position indépendamment de Rrn3. Cette observation semble corréler avec une hypothèse précédente ayant suggéré que cette polymérase serait dans un état d'élongation stable (Chapitre 3: Herdman et al., 2017). Finalement, il est raisonnable de penser que la différence au niveau du profil de PolI entre les lignées cellulaires est due à un changement au niveau de l'occurrence de l'initiation et non pas au niveau de l’élongation. L'hypothèse la plus vraisemblable est que les gènes ribosomiques dans les cellules ES sont donc moins "chargés" en PolI.