Chapitre 4 : Caractérisation de la transcription ribosomique dans des cellules
4.2. Matériel et méthodes
4.2.1.
Culture cellulaire
4.2.1.1. NIH3T3 et MEFs
Cellules issues d’ATCC, culture à 37°C 5% CO2 du DMEM, 2.2g/l de NaHCO3
et 10% FBS. Culture jusqu’à maximum 90% de confluence avant de les séparer pour un maximum de 1:10. Les MEFs ont été cultivées dans du milieu Dulbecco’s modified Eagle (DMEM)-haut niveau de glucose (Life Technologies), complété avec 10% de sérum de veau fœtal (Wisent), et un cocktail Antibiotique/Antimycotique (Wisent).
4.2.1.1.1. Privation de sérum
Les cellules NIH3T3 sont cultivées entre 60% et 80% de confluence dans du milieu Dulbecco’s modified Eagle (DMEM)-haut niveau de glucose (Life Technologies), complété avec 10% de sérum de veau fœtal (Wisent), et un cocktail Antibiotique/Antimycotique (Wisent) (milieu complet). Le milieu de culture est ôté et un lavage est réalisé avec le même milieu sans le sérum de veau fœtal. Après le lavage, les cellules sont laissées 20h en culture. Pour l’ajout de sérum, le milieu complémenté est préchauffé dans un contenant aéré dans l’incubateur, puis le milieu sans sérum est ôté et remplacé par le milieu complet. Pour l’ajout de PD98057 (Calbiochem), l’inhibiteur est rajouté à une concentration de 50µM dans un milieu sans sérum préchauffé de la même manière que précédemment.
4.2.1.1.2. Traitement CX-5461 et Actynomycin D
Les cellules NIH3T3 sont cultivées entre 60% et 80% de confluence dans du DMEM complet. L’inhibiteur de la transcription ribosomique CX-5461 (APExBIO) est ajouté dans du milieu complet préchauffé dans l’incubateur à une concentration de 10µM. L’actinomycin D (Calbiochem) est ajouté de la même manière à une concentration de 50ng/ml. Au moment du traitement le milieu est entièrement remplacé.
4.2.1.2. Culture des cellules souches embryonnaires
Tous les pétris utilisés ont été préalablement traités 30min avec 0.1% de gélatine. Pour un pétri de 35mm une quantité initiale de 0.5x106 cellules a été
ensemencé dans du milieu sans sérum (Serum-Free ES : SFES) en présence de deux inhibiteurs des kinases 9 MEK et GSK3 (2i) ainsi que de LIF. Le milieu SFES est fait à partir d’un ratio 50:50 de milieu neurobasal supplémenté avec du B27 (Gibco) et du milieu DMEM/F12 supplémenté avec du N2 (Gibco), 1% Pen/Strep (Gibco), et 1% Glutamax (Gibco). Juste avant usage, les inhibiteurs PD03259010 (1 µM, Stemgent) et CHIR99021 (3 µM, Stemgent), ainsi que 10 ng/ml de LIF sont ajoutés.
4.2.2.
Immuno-Précipitation de Chromatine
La technique de ChIP a été réalisée majoritairement de la même manière que décrite dans la partie 3.4.5. Les cellules sont re-suspendues avec de l’Accutase (Sigma) puis comptées. Après une centrifugation à 1000rpm 5min, les cellules sont re-suspendues dans du PBS à une concentration de 20x106 cellules/ml. La
fixation à 1% formaldéhyde est réalisée en suspension. La sonication a également été mise au point pour les cellules souches embryonnaires, elle est réalisée dans 1.5ml de tampon de sonication pour 100x106 cellules.
4.2.3.
Analyse du séquençage haut débit
L’analyse des données de séquençage à haut débit a été réalisée comme décrit dans la partie 2.5.
4.2.4.
Digestion à la DNaseI
Le protocole utilisé a été précédemment publié (Hansen He et al. 2014). Un ajustement a été nécessaire sur le niveau de digestion. Au lieu de mélanger plusieurs niveaux de digestions, chaque échantillon correspondant à une quantité de DNaseI utilisée a été séquencé. La figure 4.3B correspond à l’échantillon digéré avec 2unités de DNaseI pour 5 millions de noyaux.
4.2.5.
Digestion à la MNase
4.2.6.
Séquençage au bisulfite
L’ADN génomique a été préparé et envoyé au laboratoire de Ivo Gut au centre national d’analyse gènomique de Barcelone, Espagne. Pour l’analyse des données le test qualité a été fait avec FastQc version 0.11.4 (Andrew 2010). Les données ont été triées en utilisant Trimmomatic version 0.33 (Bolger et al. 2014). Les fragments non-appariés ont été supprimés pour les analyses subséquentes. Les données triées ont été alignées avec le génome bisulfite de référence en utilisant Bismark (Krueger & Andrews 2011). Le scripte Bismark_methylation_extractor a été utilisé pour extraire le profil de méthylation CpG.
4.2.7.
Anticorps pour Western-Blot et ChIP
Les anticorps utilisés ici sont les mêmes que ceux précédemment présentés dans la partie 3.4.4.
4.2.8.
Marquage métabolique et calcul de l’élongation
Le marquage métabolique a été réalisé suivant le protocole publié (Victor Y Stefanovsky and Moss 2016).
Le comptage de l’élongation a été réalisé à partir de 2 duplicata techniques (2 pétris par temps d’incorporation) chacun ayant donné lieu à 2 gels séparés (4 gels par condition). Chacun de ces gels a été exposé sur un écran phosphore (GE Healthcare). L’incorporation de 3H a été mesurée sur une machine Amersham
Typhoon. L’intensité de l’incorporation au niveau du précurseur 47S a été calculée grâce au logiciel ImageQuant TL en mode 1D Gel analysis v8.1. Une fois calculée, la quantité d’3H incorporée a été reportée dans le tableur Excel et la
courbe d’incorporation a été mesurée selon la méthode décrite dans le chapitre du livre The Nucleolus (Victor Y Stefanovsky and Moss 2016).
4.2.9.
Comptages
4.2.9.1. Cycle Cellulaire
Au jour 0, trois différentes quantités de cellules (5x105, 1x106, 2x106) sont
mises dans trois pétris différents de 60mm (9 Pétris/ lignée cellulaire) puis un pétri est compté chaque jour pendant 3 jours. Par la suite, le taux de croissance est calculé comme suit : Cr=ln(N(t)/N(0))/t où t est le temps entre 2 mesures [N(t)
et N(0)]. Par la suite le temps de doublement (dt) est calculé ce qui représente la durée du cycle cellulaire dt=ln(2)/Cr. L’histogramme final représente la moyenne et la déviation standard de tous les échantillons. C’est résultats ont été réalisés en triplicata biologiques.
4.2.9.2. Comptage des ARNs
À chaque comptage cellulaire l’ARN des cellules a été collecté et isolé avec 1ml de Trizol (Life Technologies). Une fois dans le Trizol, les ARN sont extraits par ajout de 200 ul de chloroforme puis une deuxième extraction avec 600ul de chloroforme est réalisée. L’ARN est ensuite précipité à l’isopropanol, un lavage est fait avec de l’éthanol à 70% et finalement l’ARN est re-suspendu dans de l’eau autoclavèe. L’ARN est finalement dosé par Nanodrop et dosage Qubit (Life Technology). Une expérience de dosage d’ADN et d’ARN simultané a également été réalisée pour vérifier par une autre méthode le compte d’ARN (dosage QuBit ARN et ADN).