MicroARN et athérosclérose

Plusieurs gènes ont été identifiés comme des facteurs de risque potentiel dans la maladie d’athérosclérose (231,232).

Afin de caractériser les microARN impliqués dans l’athérosclérose, les souris développant des lésions athérosclérotiques spontanées n’exprimant plus nativement les gènes ApoE (Apolipoprotein E) ou LDLR (Low density lipoprotein receptor) ont été utilisées. Deux études ont démontré que les niveaux d’expression de miR-143, miR-145 et miR-125b dans l’aorte étaient fortement diminués chez les souris ApoE-/- (233; 234). De plus, l’inactivation du cluster miR 143/miR-145 a montré un rôle majeur de ces microARN au cours de la

différentiation des cellules musculaires lisses et a donc suggéré leur participation au cours de certaines pathologies vasculaires comme l’athérosclérose (233). Par ailleurs, l’injection d’un inhibiteur de miR-33 a permis d’augmenter la quantité de HDL inversant alors en partie le phénotype hypercholestérolémique des souris dépourvues du gène LDLR (235).

Bien que de nombreux microARN impliqués dans l’athérosclérose aient été identifiés à l’aide de modèles cellulaires et murins, les bases de données humaines fournissent des informations plus proches de la véritable pathologie. À partir de ces données, un certain nombre de microARN régulés lors de l’athérosclérose a été identifié. Tout d’abord, Cipollone et ses collaborateurs ont montré que 5 microARN (miR-100, miR-127, miR-145, miR-133a et miR-133b) étaient surexprimés dans des plaques lipidiques humaines (236). Ensuite, une analyse de tissus vasculaires sains versus athérosclérotiques a démontré la présence de 5 autres microARN surexprimés (miR-21, miR-130a, miR-27b, miR-210 et let-7f) et 2 sous-exprimés (miR-221 et miR-222) dans les lésions sclérotiques (237). De plus, une dernière étude de tissus athérosclérotique comparés à un tissu sain a confirmé la surexpression de miR-21 et miR-miR-210 et a ajouté les microARN miR-34a, miR-146a et miR-146b-5p à la liste des microARN déjà impliqués (238). Enfin l’analyse des microARN circulants a permis d’établir une liste de microARN comme marqueurs potentiels libérés dans la circulation sanguine au cours de l’athérosclérose. Par exemple, les expressions des microARN miR-17, miR-92a, miR-145 et miR-155 sont diminuées alors que celles de miR-21, miR-133a, miR-146a et miR-208a sont augmentées en condition pathologique (Tableau VII) (239,240,241).

L’utilisation des microARN dans le diagnostic ou la prévention de l’athérosclérose est toujours en cours d’évaluation.

Tableau VII: Variations d’expression des microARN endothéliaux lors de l’athérosclérose (230). MicroARN humains circulants Expression tissu athérosclérotique/sain MicroARN humains circulants Expression tissu athérosclérotique/sain

miR-21 Augmentée miR-17 Diminuée

miR-27b Augmentée miR-21 Augmentée

miR-34a Augmentée miR-92a Diminuée

miR-100 Augmentée miR-133a Augmentée

miR-127 Augmentée miR-145 Diminuée

miR-133a Augmentée miR-146a Augmentée

miR-133b Augmentée miR-155 Diminuée

miR-130a Augmentée miR-208a Augmentée

miR-145 Augmentée miR-146a Augmentée miR-146-5p Augmentée miR-210 Augmentée miR-7f Augmentée miR-221 Diminuée miR-222 Diminuée

2.4. Exploration

Les miARN étant des ARN, les techniques classiques de mesure des ARNm peuvent leur être appliquées, mais leur courte taille et l’absence de queue polyA nécessitent quelques adaptations. Le clonage des miARN est principalement utilisé pour découvrir de nouveaux miARN, et la fréquence de clonage peut dans une certaine mesure indiquer leur abondance (242). Le principe est simple. Les miARN sont séparés sur gel dénaturant de polyacrylamide, isolés, transférés dans des vecteurs de clonage après une étape d’amplification puis les clones sont séquencés. La technique de Nothern blot permet d’étudier le profil d’expression des miARN de façon plus précise mais nécessite une sonde spécifique pour chaque miARN (243). Cette technique ne peut donc être utilisée que pour la détection de miARN déjà identifiés.

Les miARN sont séparés sur gel dénaturant de polyacrylamide, transférés puis fixés sur une membrane, puis une sonde spécifique du miARN recherché est hybridée sur la membrane. Puisque les miARN sont de petite taille et présents en faible quantité parmi les ARN totaux, quelques améliorations ont été apportées, dont l’utilisation de sondes spécifiques aux miARN, modifiées chimiquement pour être plus affines envers l’ARN cible et augmentant la sensibilité du Nothern blot (244).

La technique de PCR quantitative est largement utilisée pour quantifier l’expression d’un miARN de façon spécifique dans un échantillon. Cependant, la petite taille des miARN et l’absence de queue polyA ont nécessité la modification du protocole classique de PCR quantitative. La société Applied Biosystems a développé un protocole où, à l’étape de transcription inverse, une séquence adaptatrice, spécifique du miARN cherché, est ajoutée et permet la synthèse d’une longue séquence (245). Cette séquence augmente la taille du miARN et permet l’utilisation de 2 amorces pour la PCR, l’une ciblant le miARN, l’autre ciblant la séquence ajoutée lors de la transcription inverse. D’autres protocoles, comme ceux proposés par les sociétés Qiagen, Exiqon et Quanta Biosciences, se basent sur l’ajout d’une queue polyA par une polyA polymérase, puis de l’ajout d’un adaptateur universel grâce à la queue polyA. Cet adaptateur permet l’accroche d’un primer universel. Ces protocoles ont

contraire du protocole d’Applied Biosystems qui nécessite une transcription inverse spécifique pour chaque miARN. Pour la mesure des nombreux miARN, ces techniques sont laborieuses, et l’utilisation de puces à ADN dédiées aux miARN est possible (246). Une solution intermédiaire est l’utilisation de « puces à PCR » ou microfluidic cards qui permettent la mesure simultanée de centaines de miARN par PCR quantitative, généralement plus reproductible que la mesure par puces à ADN (247).

L’hybridation in situ permet de détecter la présence de miARN dans des tissus ou des cellules. Plusieurs adaptations ont été mises au point, afin d’améliorer la sensibilité et la spécificité des protocoles d’hybridation in situ, dont l’utilisation de sondes modifiées chimiquement, l’utilisation de molécules fluorescentes ou d’une étape de PCR in situ (248).

Finalement, ces techniques de détection et/ou de dosage des miARN sont très utiles pour la mesure des miARN mais étant récentes, ces techniques nécessitent souvent une mise au point lors de leur réalisation ou de l’analyse des résultats par rapport à leur utilisation pour des ARNm. D’autres techniques, moins utilisées, ont aussi été développées et peuvent trouver leur intérêt dans des applications particulières, telles que la mesure de miARN par microbilles cotées de sondes, par transfert d'énergie bioluminescente par résonnance (BRET).

3. Microparticules

En 1946, Chargaff et al montrent pour la première fois la présence d’un facteur plasmatique, centrifugeable, participant à la coagulation. Mais ce n’est qu’en 1967 que les microparticules seront réellement identifiées. Wolf et al montrerons que l’activation plaquettaire s’accompagne de la génération de fragments membranaires de taille infra-cellulaire, riche en phospholipides et qui sont le support de la génération de la formation de la thrombine dans le plasma sans plaquettes (249). À partir de là, de nombreuses études reporteront la production in vitro de différents types de vésicules ainsi que leur présence dans le plasma humain. Aujourd’hui différents types de vésicules sont décrites dans la littérature : les corps apoptiques, les microparticules et les exosomes.

Les microparticules (MP) sont des vésicules qui peuvent être produites lors de l’apoptose mais sont souvent le reflet d’une activation cellulaire. D’une taille comprise entre 0,1 et 1µm, elles sont relarguées sans destruction de la cellule qui les produit. Les caractéristiques principales sont l’externalisation de la phosphatidylsérine ainsi qu’une double membrane intègre, non perméable.

Il est admis que les MP peuvent provenir de tout type cellulaire, aussi bien des cellules circulantes ou composantes la paroi du vaisseau que cellules comme les cardiomyocytes ou les hépatocytes. Les MP issues des cellules circulantes et du vaisseau sont celles majoritairement étudiées, on les retrouve dans différentes proportions dans le sang en fonction de leur origine (figure 29.)