Mesure du pouvoir antioxydant

En 2011, l’EFSA a publié ses recommandations pour la sélection d’une molécule antioxydante. La démonstration d’un effet antioxydant doit ainsi être basé sur l’utilisation de plusieurs critères (EFSA Panel on dietetic products, 2011).

1.4.2.1. Mesures globales du pouvoir antioxydant

Les études sur l’homme doivent montrer un changement dans la capacité antioxydante globale du plasma. Les méthodes utilisables sont par exemple les méthodes TRAP (total reactive antioxidant potential), TEAC (trolox-equivalent antioxidant capacity), FRAP (ferric reducing antioxidant potential) ou ORAC (oxygen radical absorbance capacity). Cependant, il n’est pas clairement établi qu’un changement dans la capacité antioxydante globale du plasma puisse exercer un effet physiologique bénéfique chez l’hôte. Des changements dans l’induction enzymatique (la superoxyde dismutase (SOD), la catalase, la glutathion peroxydase (GPx)) ou dans la limitation de la diminution du glutathion réduit (GSH) sont considérés comme étant physiologiquement bénéfiques pour l’hôte uniquement s’ils sont associés à des marqueurs montrant une protection des cellules ou des molécules contre le stress oxydant. Cela peut être une protection des lipides, des protéines ou de l’ADN.

1.4.2.2. Mesure de la protection des lipides

Les méthodes permettant de démontrer une protection des lipides face au stress oxydant consistent à mesurer des changements dans le taux urinaire de F_2α-isoprostanes par chromatographie gazeuse ou techniques immunologiques. La mesure de l’oxydation des LDL dans le sang peut également être réalisée par techniques immunologiques. La mesure des phosphatidylcholine hydroperoxydes (PCOOH) dans le sang ou dans les tissus par HPLC est également considérée comme étant un marqueur acceptable de l’oxydation lipidique. Enfin,

les autres méthodes comme la mesure du taux de malondialdéhyde (MDA) ou des diènes conjugués ne sont pas jugés comme pertinentes mais peuvent être associées aux méthodes décrites ci-dessus.

1.4.2.3. Mesure de la protection des protéines

La mesure directe de l’oxydation protéique peut être réalisée in vivo dans le plasma par la mesure des changements dans les acides aminés des protéines par HPLC-MS. La mesure des sous-produits issus de l’oxydation des protéines (par exemple les carbonyles) peut être utilisée en complément de la mesure directe de l’oxydation protéique.

1.4.2.4. Mesure de la protection de l’ADN

La mesure directe de l’oxydation de l’ADN peut être obtenue in vivo par l’utilisation d’un test des comètes modifié (utilisation de l’endonucléase III qui détecte spécifiquement les pyrimidines oxydés). Ce test n’étant que quantitatif, il faut donc utiliser un contrôle approprié. Le test des comètes traditionnel (SCGE) détecte les cassures de l’ADN et n’est pas spécifique de l’oxydation. L’analyse de la 8-oxoguanine dans le sang (lymphocytes) est également utilisée pour détecter l’effet du stress oxydant sur l’ADN.

1.4.2.5. Démonstration in vitro de l’effet antioxydant

In vitro la plupart de ces techniques ne peuvent être réalisées pour tester l’effet potentiel de souches probiotiques sur le pouvoir antioxydant. Ainsi, pour screener rapidement des souches probiotiques, la capacité à résister au stress oxydant et à piéger ou éliminer les ROS est également le plus souvent utilisée. Les méthodes globales sont également utilisées (ORAC, FRAP, SOD,…). De plus, la mesure du TAA (Total Antioxidant Activity), du TAS (Total Antioxidant Statut) et du statut redox est également souvent employée in vitro. Le TAA reflète l’état de la fraction lipidique dans les systèmes de défenses antioxydantes et le TAS celui de la fraction soluble. Le statut redox représente la ratio glutathion oxydé / glutathion réduit (GSSG/GSH). A ces techniques in vitro, il semble donc intéressant d’ajouter un modèle intermédiaire, faisant intervenir des cellules. A ce titre, le test KRL ou le test des comètes modifié peuvent être de bon modèles d’étude.

Le test KRL est un test biologique de mesure du potentiel global de défense antiradicalaire. Ainsi, il permet de mesurer la résistance globale du sang vis-à-vis de l’agression des radicaux libres. Il s’agit de soumettre un échantillon de sang ou une suspension d’hématies à une agression radicalaire linéaire et progressive dans des conditions strictement contrôlées et standardisées. Tous les systèmes enzymatiques et chimiques de l’échantillon se mobilisent pour protéger l’intégrité des cellules jusqu’à leurs lyses. La mesure de la diminution de l’absorbance permet de suivre la disparition progressive des cellules. La résistance du sang à l’attaque radicalaire est exprimée par le temps nécessaire à la lyse de 50% des cellules sanguines (Figure 6) (Prost, 1992).

Figure 6 : Principe du test KRL (Prost, 1992).

Cette mesure du potentiel de défense antiradicalaire global tient compte de toute la complexité des systèmes de défenses mise en jeu par les cellules. Théoriquement, la résistance antiradicalaire érythrocytaire doit conduire à une courbe avec un temps de demi-lyse plus élevé avec des molécules antioxydantes comparativement à des témoins.

Le test des comètes est une technique d’électrophorèse sur gel d’agarose mise au point par Singh et al. (1988) permettant de détecter des fragmentations de l’ADN de cellules individualisées (Singh et al., 1988). L’essai des comètes en conditions alcalines permet de détecter non seulement les cassures doubles brins (révélées en pH neutre) mais aussi les lésions simples brins et les sites alcali-labiles résultants d’une exposition à un agent prooxydant et/ou génotoxique, rendant ainsi l’essai plus sensible (Olive and Banath, 2006). Une version modifiée du test des comètes peut également être réalisée en présence de la

formamidopyrimidine DNA-glycosylase (FpG) pour détecter spécifiquement les dégât à l’ADN liés au stress oxydant (Göttel, 2009). La FpG, d’origine bactérienne est une des enzymes responsables de la réparation de lésions à l’ADN. Elle possède des activités N-glycosylase et β-lyase capables de reconnaître et d’exciser les bases d’ADN apuriniques converties en cassures détectables par le test des comètes réalisé en conditions alcalines. L’analyse différentielle des lames incubées en présence de FpG et de celles incubées en l’absence de FpG permet d’évaluer la présence de dommages oxydatifs qui ne sont habituellement pas quantifiables dans la version non modifiée de l’essai des comètes.