3. Caractérisation des Capacités Réductrices de B. bifidum
3.1. Mesure du pH et du E
hLe pH est suivi par une électrode pH combinée (Inlab 405 ; Mettler Toledo, Paris, France). L’électrode pH est nettoyée avant utilisation au moyen d’une solution de pepsine/HCl puis calibrée à l’aide de solutions tampons d’étalonnage (pH 4 et 7). Le potentiel redox est suivi par une électrode redox combinée (Pt 4805 ; Mettler Toledo). Avant utilisation, l’anneau de platine de l’électrode est poli à l’aide d’une poudre d'alumine (oxyde d'alumine, VWR Prolabo, Lyon, France) afin de restaurer l’état de la surface du platine. L’électrode est contrôlée dans de l’eau du robinet. Trois mesures sont comparées et doivent être incluses dans l'intervalle de confiance autour de leur moyenne (calculée à 20 mV, 95% de niveau de confiance) (Abraham, 2007). Pour les conditions Azote et Azote – Hydrogène, les mesures du pH et du redox sont réalisées en anaérobiose dans l’enceinte Bactron I.
3.2. Mesure de l’oxygène dissous
La teneur en oxygène du milieu a été suivie par un système de fibre optique spécifique (World Precision Instruments, Sarasota, USA). Le principe de mesure est basé sur sur le principe de quenching dynamique de la luminescence causé par la collision entre des molécules d’oxygène et le luminophore présent au niveau de la fibre optique. La luminescence est une émission de lumière dite « froide », produite par le retour des électrons excités vers un état de moindre énergie. Tout d’abord, une lumière va être envoyée vers la suspension à doser via la fibre optique. Sans oxygène, la lumière va exciter le luminophore présent au niveau de la
fibre. Le luminophore va à son tour émettre de la lumière que la fibre optique va détecter et retransmettre jusqu’à un système d’acquisition. En revanche, lorsque l’oxygène est présent dans le milieu, cette dernière va entrer en collision avec le luminophore qui va perdre alors son état excité. Dans ce cas, aucun signal lumineux ne va être re-transmis vers le système d’acquisition. En d’autres termes, plus l’oxygène est présent dans le milieu à tester et moins le signal lumineux ré-émit par le luminophore sera important.
Les systèmes de mesure d'oxygène par fibre optique conventionnels sont limités dans leur précision par la stabilité de la source lumineuse et par les fluctuations de lumière. En utilisant une détection par durée de vie de luminescence, les mesures ne sont pas affectées par la stabilité de la lumière, par les fluctuations d'intensité causées par le pliage de la fibre ou les changements des propriétés optiques des échantillons (turbidité, indice de réfraction, coloration, etc.). De plus, cette fibre optique présente l’avantage par rapport au système classique ampérométrique (électrode de Clark) de ne pas consommer l’oxygène du milieu pendant la mesure. La fibre optique est connectée à un système d’acquisition (OxyMini, WPI) et de traitement des données (SpectraSuite, WPI) permettant de suivre en continu la teneur en oxygène dissous du milieu. Le capteur est calibré en deux points, à 100% de saturation d'air et 0%. Ainsi, une solution à 0% d’oxygène est réalisée par un dégazage de l’eau distillée à l’azote et une solution à 100% de saturation d’air est obtenue en faisant buller le milieu avec de l’air ambiant.
3.3. Acquisition des données
Les électrodes pH et redox ainsi qu’une sonde de température sont connectées à une interface de contrôle multi-canaux (ELIT 8088 ; Bioblock, Illkirch, France) permettant l’acquisition des données en temps réel vers un ordinateur. Le pH et le potentiel redox mesuré (Em ; mV) sont enregistrés simultanément. Sur la base de la valeur de l’électrode de référence (Eref) à la température de croissance (Eref = 197 mV à 37 °C), les valeurs du Em, exprimées en comparaison avec l’électrode de référence Ag/AgCl, sont converties en Eh (potentiel redox exprimé en comparaison avec l’électrode de référence à hydrogène, Eh = Em + Eref). Dans le but de corriger l’effet du pH sur les valeurs du Eh, nous avons calculé les valeurs du Eh7. Les valeurs du Eh7 correspondent au Eh à pH = 7. Le Eh7 est calculé en appliquant l’équation de Leitsner et Mirna (Leistner and Mirna, 1959) : Eh7 = (Eh - α (7 - pHx), α étant le facteur de
corrélation Eh–pH et dont la valeur a été déterminée expérimentalement (38 mV/unité pH pour le lait et 30 mV/unité pH pour le MRS*) et pHx le pH du milieu.
3.4. Suivi des paramètres cinétiques
L'étude de Cachon et al. a repris les mêmes outils de caractérisation que ceux utilisés pour étudier la cinétique d’acidification dans le but de mesurer les aptitudes réductrices de souches de bactéries lactiques (Cachon et al., 2002). Il existe plusieurs méthodes pour étudier la cinétique d'acidification. Cependant, la plus répandue est celle de Corrieu et al. (logiciel CINAC) impliquant le calcul des paramètres caractéristiques des cinétiques d'acidification : la vitesse maximale d’acidification (Vm), le temps (Tm) et le pH (pHm), auxquels la vitesse maximale d'acidification est atteinte (Corrieu et al., 1989). Ces paramètres apparaissent d’après Picque et al. comme les meilleurs descripteurs des cinétiques (Picque et al., 1992). Du fait de l’intérêt des paramètres déterminés et de la reconnaissance de la méthode par l’ensemble de la profession, celle-ci a été choisie par Cachon et al. pour établir les paramètres cinétiques de réduction (Cachon et al., 2002). Le calcul de la vitesse d'acidification (Va = dpH/dt, unité pH/h) et de la vitesse de réduction (Vr = dEh/dt, unité mV/h) permet de déterminer la vitesse maximale d'acidification (Vam, unité pH/h) et la vitesse maximale de réduction (Vrm, unité mV/h), ainsi que les temps auxquels ces vitesses sont atteintes, respectivement Tam (h) et Trm (h), et le pH auquel ces maximums sont atteints (pHam et pHrm) (Figure 26).
Figure 26 : Courbes typiques d'acidification, de réduction et vitesses d'acidification et de réduction associées.
3.5. Filtration et ajout de NEM
Les cultures de B. bifidum réalisées dans des flacons modifiés avec du MRS dégazé au N2 comme décrit précédemment sont filtrées afin de connaître l’impact de la présence des
micro-organismes sur le Eh7 final. A la fin de l’étape de réduction (Eh7 ~ –180 mV), 10 mL de culture bactérienne sont prélevés en anaérobiose dans l’enceinte Bactron I à l’aide d’une seringue puis filtrés avec un filtre de 0,22 µm. Le Eh7 du filtrat est ensuite mesuré à l’aide d’une électrode redox.
L’utilisation du N-éthylmaleimide (NEM) réagissant spécifiquement avec les thiols permet d’étudier le rôle de ces groupements dans la réduction du milieu. Une solution de NEM est ajoutée dans l’enceinte anaérobie à la fin de l’étape de réduction de la culture. La solution stock de NEM est de 1 M dans une solution de méthanol : eau (3 : 1) et la concentration finale dans le milieu de culture est de 25 mM.