5.1. Analyses des acides gras
5.1.1. Extraction des lipides et préparation des esters méthyliques d’acides
gras
Les lipides totaux ont été extraits des culots cellulaire de B. bifidum selon la méthode de Folch et al. (Folch et al., 1957) avec quelques modifications. Les culots cellulaires sont lavés, re-suspendus dans 2 ml de PBS (concentration finale de 5x109 UFC/mL) et une extraction avec 4 volumes d’un mélange chloroforme/méthanol (2 :1 v/v) et 1 volume de NaCl 0,73% est
réalisée. Après 2 minutes de vortex, le mélange est centrifugé (3 min, 1000 g). La phase inférieure est transférée dans un tube en verre, puis les solvants sont évaporés sous azote et le tube est pesé pour déterminer la masse approximative de lipides. Les lipides sont ensuite transméthylés par ajout de trifluorure de bore (dans du méthanol) selon la méthode de Morrison and Smith (Morrison and Smith, 1964). Aucune différence dans la quantité de lipides n’a été mise en évidence entre les trois conditions de culture.
5.1.2. Analyse en chromatographie gazeuse des esters méthyliques d’acides
gras
Les esters méthyliques d’acides gras sont analysés à l’aide d’une chromatographie gazeuse Hewlett Packard Model 5890 (Palo Alto, CA, USA) avec une colonne CPSIL-88 (100 m × 0.25 mm, épaisseur du film 0.20 m; Varian, Les Ulis, France). L’hydrogène est utilisé comme gaz vecteur (à une pression de 210 kPa). La température du four est maintenue à 60 °C pendant 15 min, puis augmentée à 85 °C à une vitesse de 3 °C/min et ensuite à 190 °C à une vitesse de 20 °C/min et finalement maintenue à cette température. L’injecteur et le détecteur à ionisation de flamme sont maintenus respectivement à 250 °C et 280 °C. Les esters méthyliques d’acides gras sont identifiés en comparaison avec des étalons internes. Les données sont analysées à l’aide du logiciel Galaxie (Varian, Les Ulis, France) et exprimées en pourcentage par rapport aux acides gras totaux.
5.2. Analyse de la fluidité membranaire
La fluidité membranaire a été déterminée en mesurant l’anisotropie de fluorescence en utilisant le 1,6-diphényl-1,3,5-héxatriène (DPH) (Laroche et al., 2001). Une solution mère à 1 mM de DPH (Sigma Aldrich) est réalisée dans du tétrahydrofurane. Les cellules sont lavées deux fois et le culot (108 UCF) est repris dans 3 mL de PBS. 9 µL de DPH sont ajoutés dans la solution (concentration finale en sonde 3 µM). Les échantillons sont agités et placés dans le porte cuvette du spectrofluorimètre (Hitachi F-4500, Japan). La température des échantillons est mesurée à l’aide d’un thermocouple immergé dans la solution à analyser. Les mesures sont effectuées sur une spectromètre Fluorolog 3 (Jobin-Yvon, Horiba Group, Edison, NJ), à polarisation de fluorescence. Les longueurs d’onde d’émission et d’excitation sont respectivement de 360±2 nm et de 431±5 nm (Simonin et al., 2008). Le principe de mesure
est le suivant : l’échantillon, constitué de molécules fluorescentes, est éclairé par un faisceau lumineux polarisé suivant l’axe Z et se propageant parallèlement à l’axe X (Figure 29). On mesure l’intensité lumineuse émise par l’échantillon dans la direction Y, dans les deux polarisations X et Z. Ces intensités, notées I┴ et I║ respectivement, permettent de calculer le paramètre d’anisotropie (r) :
r = (I║ – I┴) / (I║v + 2 I┴) ;
Figure 29 : Principe de la mesure d'anisotropie de fluorescence (Le Floc'h, 2004).
La mesure de l’intensité de fluorescence est corrigée en soustrayant l’intensité lumineuse des cellules non marquées et du DPH dans du tampon. Le bruit de fond n’excède pas 10% de l’intensité des essais.
5.3. Adhésion aux solvants
L’adhésion microbienne aux solvants (Microbial adhesion to solvents ou MATS) est mesurée selon la méthode de Rosenberg et al. avec quelques modifications (Rosenberg et al., 1980; Bellon-Fontaine et al., 1996). Les bactéries sont lavées deux fois et re-suspendues dans 5 mL de PBS (concentration cellulaire finale de 108 UFC/mL). L’absorbance de la suspension est mesurée à 600 nm (A0). 1mL de solvant est ajouté à 3 mL de suspension bactérienne. Après 10 min de co-incubation à 37 °C, les échantillons sont vortexés pendant 2 min. La phase aqueuse est retirée après 20 min d’incubation à 37 °C et l’absorbance à 600 nm (A1) est lue. Trois solvants ont été utilisés : le chloroforme, l’hexadécane et l’acétate d’éthyle. L’adhésion à l’hexadécane reflète de l’hydrophobicité des souches testées. Les deux autres solvants renseignent sur les caractéristiques de donneur (chloroforme) ou d’accepteur (acétate
d’éthyle) d’électrons (Bellon-Fontaine et al., 1996). L’adhésion au solvant est calculée de la manière suivante :
% adhérence = (1 – A1/A0) x 100
5.4. Mesure de l’auto-agrégation
Les tests d’auto-agrégation sont effectués suivant la méthode de Del Re et al. (Del Re et al., 2000). Les bactéries sont cultivées 18 h à 37 °C en milieu MRS* liquide. Les cellules sont centrifugées (15 min, 4500 g), lavées deux fois dans du PBS et re-suspendues dans du PBS à une DO de 1. 4 ml de suspension cellulaire sont ensuite vortexés pendant 10 secondes et l’auto-agrégation est déterminée pendant 5 h d’incubation à 37 °C. Chaque heure, 0,1 ml est prélevé sur le dessus de la suspension et une mesure d’absorbance est effectuée. Le pourcentage d’auto-agrégation est exprimé de la façon suivante :
% auto-agrégation = (1 – At/A0) x 100
5.5. Adhésion aux cellules épithéliales
5.5.1. Culture cellulaire
L’adhérence aux cellules épithéliales a été analysée par l’utilisation de cellules intestinales Caco-2, lignée cellulaire d'adénocarcinome colique humain exprimant plusieurs marqueurs caractéristiques des cellules villositaires de l’intestin. Ces cellules sont obtenues auprès de l’ATCC. Elles sont cultivées à 37 °C sous une atmosphère comprenant 5% de CO2, dans du milieu essentiel minimum Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum de veau fœtal inactivé (SVF) (30 min, 56 °C), 1% d’acides aminés non essentiels et 1% de glutamine. Pour les essais d’adhésion, les Caco-2 sont spécifiquement cultivées sur des plaques 24 puits. Les cellules sont ensemencées à une concentration de 2x105 cellules / puits. Le milieu de culture est changé tous les deux jours.
5.5.2. Adhésion in vitro aux cellules Caco-2
Les tests ont été réalisés comme décrit par Forestier et al. avec quelques modifications (Forestier et al., 2001). Les cellules Caco-2 sont utilisées après 15 jours d’incubation, à un
stade post-confluent, avec changement de milieu tous les deux jours. Au moins une heure avant le test d’adhésion, le milieu des cellules est remplacé par du DMEM non supplémenté en SVF. L’adhérence de B. bifidum aux cellules épithéliales est réalisée en ajoutant 50 µ L de bactéries (5x108 UFC/ml) par puits contenant les cellules Caco-2 à post-confluence (1 ml de milieu DMEM par puits). Après incubation à 37 °C pendant 1 h, les cellules sont lavées trois fois avec du PBS et traitées sur glace avec du triton X-100 pendant 5 minutes pour lyser les cellules. Le pourcentage de cellules bactériennes adhérentes est déterminé en réalisant des dilutions successives sur boites gélosés mMRS.