La matrice pyrazole

La synthèse de nouveaux composés dérivés de pyrazoles a été faîte en deux temps par modifications successives des fonctions principales, dans le but d’avoir une transition progres-sive entre les prolino-homo-tryptophanes et les dérivés pyrazoles. Cela a permis de visualiser en modélisation l’impact de chaque modification sur les interactions avec l’enzyme. Dans un premier temps, c’est uniquement la matrice centrale pyrrolidine qui a été modifiée par un pyra-zole, tout en conservant les autres groupements fonctionnels comme l’indole et le phényl. En-suite, contrairement aux prolino-homo-tryptophanes, le travail de modélisation s’est concentré sur la partie indole qui a été substituée par divers pharmacophores telles que les fonctions

py-Chapitre 4 : Pyrazoles

133 ridine ou diazine (pyrimidine, pyridazine) (schéma 80). La pyridine et les diazines ont été

choi-sies car, en tant que fonctions hétérocycliques, elles permettent d’introduire des hétéroatomes susceptibles de former des interactions stabilisantes avec les acides aminés qui entourent la poche de l’indole.

Schéma 80 : De la matrice proline à la matrice pyrazole

II.1 Modélisation moléculaire

L’étude de modélisation moléculaire a permis de concevoir quatre dérivés pyrazoles où le cycle diazole est fonctionnalisé en position 3 par divers pharmacophores et en position 5 par un groupement éthylbenzène (schéma 81).

Schéma 81 : Structure des dérivés pyrazoles

La modélisation moléculaire des différents composés a montré que la matrice pyrazole permet d’orienter de manière bidirectionnelle ses substituants (indole, pyridine, diazines, phényl) dans les deux poches de la DNMT1. En effet, même si les composés se positionnent plutôt dans la poche où se trouve le SAM, le cycle diazole impose une contrainte conformationnelle qui per-met au cycle aromatique de se projeter vers la poche de l’enzyme dans laquelle se positionne l’ADN. Par rapport au cycle pyrrolidine, les atomes d’azote du pyrazole permettent de nou-velles interactions en établissant des liaisons hydrogène comparables à celles des groupements hydroxyles du ribose, qui constitue la partie centrale de la structure du SAM (schéma 82).

Chapitre 4 : Pyrazoles

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Schéma 82 : Interactions communes du pyrazole (vert) et du ribose du SAM (bleu) avec le résidu Glu 1171

De la même manière que les prolino-homo-tryptophanes, ces composés ont été modélisés dans le logiciel MOE et minimisés en utilisant le champ de force AMBER 12.

La modélisation du composé pyrazolo-indole LCPK24 montre plusieurs interactions

favo-rables avec les acides aminés qui structurent la poche du SAM. D’une part, le pyrazole induit une liaison hydrogène entre son atome d’azote pyrrole et l’acide carboxylate du résidu acide glutamique Glu 1171. D’autre part, grâce à l’orientation imposée par le pyrazole une deuxième liaison hydrogène se forme entre l’atome d’azote de l’indole et le groupement thiol du résidu cystéine Cys 1194. Enfin, après minimisation de la molécule, trois interactions de type N-H/π ou C-H/πse mettent en place ; la première entre le cycle à cinq chaînons de l’indole et l’atome d’hydrogène porté par l’azote impliqué dans la liaison amide du résidu cystéine Cys 1194 ; la deuxième entre le pyrazole et l’atome de carbone en position alpha (C-Hα) du résidu phényla-lanine Phe 1148 ; la troisième entre le phényl et l’atome de carbone en position alpha (C-Hα) du résidu proline Pro 1228 (schéma 83).

En conclusion, la substitution de la matrice pyrrolidine centrale par une matrice pyrazole permet d’obtenir des interactions différentes de celles observées avec les prolino-homo-tryptophanes et notamment d’orienter le noyau indole de manière à induire une nouvelle interaction de type N-H/πavec la cystéine Cys 1194.

Chapitre 4 : Pyrazoles

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Schéma 83 : Interactions de LCPK24 avec la DNMT1

Dans cette nouvelle approche nous avons remplacé le noyau indole en position 3 par divers hétérocycles.

Tout d’abord, le pyrazole a été fonctionnalisé par une pyridine dans le but de positionner un atome d’azote, qui pourrait jouer le rôle d’accepteur de liaison hydrogène, en face de la fonction amide du résidu cystéine Cys 1194. L’étude de modélisation moléculaire du composé LCPK23

montre bien que cette interaction se forme grâce au cycle diazole qui permet une répartition bidirectionnelle de ses substituants en position 3 et 5. De plus, les atomes d’azotes du pyrazole établissent deux autres liaisons hydrogène ; l’une avec l’atome d’hydrogène porté par l’atome d’azote de la fonction amide du résidu méthionine Met 1172 ; l’autre avec le carboxylate du résidu acide glutamique Glu 1171. Par ailleurs, la contrainte conformationnelle imposée par le pyrazole oriente la molécule de manière à favoriser d’une part la formation d’une interaction π-stacking de type « T-shaped » entre le cycle aromatique de la chaîne latérale du résidu phény-lalanine Phe 1148 et le pyrazole ; et d’autre part la formation d’une interaction de type C-H/π entre le phényl et l’atome de carbone en position alpha (C-Hα) du résidu proline Pro 1228 (schéma 84).

Chapitre 4 : Pyrazoles

136 Enfin, LCPK23 s’insère parfaitement dans le site actif comme le montre la surface de Van der

Waals (en toile grise) où le pyrazole permet de projeter le groupement phényl vers la poche de l’ADN. Une hypothèse envisageable pourrait être l’introduction de substituants sur le cycle aromatique afin de cibler à nouveau le résidu cystéine catalytique Cys 1129, mais cette fois avec une matrice pyrazole qui permet une orientation et donc des interactions différentes des composés dans le site actif.

Schéma 84 : Interactions de LCPK23 avec la DNMT1

Dans un second temps deux diazines ont été envisagées pour fonctionnaliser le pyrazole à la place du noyau indole, d’abord une pyrimidine puis une pyridazine. De la même manière que la pyridine l’objectif est d’introduire des atomes d’azotes à diverses positions sur le cycle à six chaînons susceptibles d’agir comme accepteurs de liaisons hydrogène.

Le schéma 85 représente l’étude de modélisation du composé LCPK25 où le pyrazole est

fonc-tionnalisé en position 3 par une pyrimidine. Dans ce cas également, le pyrazole permet à la fois d’orienter le phényl vers la poche du substrat ADN de manière à engendrer une interaction de type C-H/π avec le carbone en position alpha (C-Hα) du résidu proline Pro 1228 ; mais aussi la formation de deux liaisons hydrogène avec le carboxylate du résidu acide glutamique Glu 1171

Chapitre 4 : Pyrazoles

137 grâce à son atome d’azote de type pyrrole. Enfin, de manière similaire à la pyridine, la pyrimi-dine établit une dernière liaison hydrogène avec l’atome d’hydrogène porté par l’atome d’azote impliqué dans la liaison amide du résidu cystéine Cys 1194. Toutefois, l’ajout d’un deuxième atome d’azote en position 3 du cycle diazine n’apporte aucune autre interaction stabilisante avec les acides aminés de la poche du SAM.

Schéma 85 : Interactions de LCPK25 avec la DNMT1

En dernier lieu, une pyridazine a été utilisée pour fonctionnaliser le pyrazole en position 3. La minimisation du composé LCPK26 montre que l’ajout d’un atome d’azote en position 2 du

cycle diazine induit la formation d’une liaison hydrogène supplémentaire entre le nouvel atome d’azote et l’atome d’hydrogène porté par l’atome d’azote impliqué dans la liaison amide du résidu cystéine Cys 1194. Ainsi les deux atomes d’azotes adjacents en position 1 et 2 du cycle diazine établissent chacun une liaison hydrogène avec le résidu qui leur fait face. Par ailleurs, les atomes d’azotes de type pyrrole et pyridine du cycle pyrazole permettent là aussi de mimer les interactions des groupements hydroxyles du ribose du SAM grâce aux trois liaisons hydro-gène qu’ils forment respectivement avec la fonction amide du résidu méthionine Met 1172 et la fonction carboxylate du résidu acide glutamique Glu 1171. Enfin, une interaction π-stacking

Chapitre 4 : Pyrazoles

138 de type « T-shaped » s’établit entre le noyau pyrazole et la chaîne latérale du résidu phénylala-nine Phe 1148 (schéma 86).

Schéma 86 : Interactions de LCPK26 avec la DNMT1

L’ensemble des interactions stabilisantes établies entre les divers composés pyrazoles et les acides aminés du site actif de la DNMT1 pourraient améliorer l’énergie libre de liaison (∆G), par diminution de l’entropie et amélioration de l’enthalpie, et par conséquence accroître l’affinité potentielle des composés pour l’enzyme. Une augmentation de l’énergie libre de liai-son peut être visualisée notamment lors du calcul des conformères d’une molécule dans le vide.

Il est important de garder à l’esprit que les molécules sont soumises à deux contraintes diffé-rentes, une contrainte conformationnelle imposée par leur structure via les cycles pyrrolidine ou pyrazole, et une contrainte environnementale imposée par le site actif de la DNMT1. Lors d’une étude conformationnelle c’est la contrainte environnementale qui est prise en compte. Une étude conformationnelle permet de simuler l’ensemble des conformations qu’une molécule peut adopter dans un vide théorique, donc dans un espace dénué de site actif et d’acides aminés où la molécule est libre de toute contrainte extérieure. On compare ensuite chaque conformère « libre » à la conformation modélisée dite « contrainte » dans l’enzyme. Plus la conformation

Chapitre 4 : Pyrazoles

139 modélisée « contrainte » est proche d’une conformation libre, plus la conformation modélisée se rapproche de la conformation réellement adoptée par le composé lorsqu’il se liera à l’en-zyme. En d’autres termes, la conformation théorique sera proche de la conformation bioactive. En effet, si le composé est trop contraint dans le site actif, malgré la présence d’interactions stabilisantes, la demande énergétique pour adopter cette conformation sera telle que la confor-mation modélisée sera peu probable dans un milieu biologique. Enfin, les études de modélisa-tions restent théoriques doivent toujours être comparées aux études expérimentales.

Dans le cas des dérivés pyrazoles le calcul des conformères dans le vide montre que ces derniers sont moins contraints dans le site actif que les prolino-homo-tryptophanes. C’est-à-dire que, pour les pyrazoles, la conformation théorique qui a été modélisée dans le site actif est suscep-tible d’être proche de la conformation bioactive réellement adoptée par ces composés lorsqu’ils se lient à l’enzyme. Ainsi, les pyrazoles pourraient être de meilleurs inhibiteurs de la DNMT1 que les prolino-homo-tryptophanes. Cette hypothèse sera confirmée ou infirmée dans le Cha-pitre 5 dédié à l’évaluation biochimique.

II.2 Résultats et discussion

II.2.1. Synthèse de LCPK24

La stratégie de synthèse du composé LCPK24 est décrite dans le schéma 87. Celle-ci

implique l’utilisation d’un couplage de Sonogashira où le pyrazole est formé in situ grâce à l’ajout d’hydrazine monohydrate.

Chapitre 4 : Pyrazoles

140 Réactifs et conditions : (a) Mo(CO)6, Pd(OAc)2, CuI, [(t-Bu)3PH]BF4, CsCO3, Toluène - CH3CN, 80°C, 18h (b) N2H4.H2O (c) HCl /Dioxane 4M, TA, 48h

Cette voie de synthèse, développée par Stonehouse et al.,153 permet la formation de pyrazoles via une réaction one-pot. Dans un premier temps, un couplage de Sonogashira permet de fonc-tionnaliser l’alcyne commercial prop-2-yn-1-ylbenzene D par le tert-butyl

3-iodo-1H-indole-1-carboxylate 6 synthétisé. La présence de molybdène hexacarbonyle permet une insertion CO à

la suite de l’étape de transmétallation. L’ajout d’hydrazine monohydrate permet de former le composé 16 par cyclocondensation. Le composé final LCPK24 est obtenu après déprotection

en conditions acides du groupement tert-butoxycarbonyle qui protège l’atome d’azote du noyau indole.

II.2.2. Synthèse de LCPK23, LCPK25 et LCPK26

La synthèse des composés LCPK23, 25 et 26 a nécessité la mise en place d’une nouvelle

stratégie de synthèse. En effet, le couplage de Sonogashira s’est avéré inefficace dans le cas des substituants pyridine, pyrimidine et pyridazine. Pour pallier ce problème, plusieurs conditions de couplage ont été testées, notamment en remplaçant le Pd(OAc)2 à degré d’oxydation +2 par du Pd2(dba)3 à degré d’oxydation 0, ou encore en changeant de base (DIEA au lieu de CsCO3) ou bien de solvant afin d’améliorer la solubilité (DMF au lieu de toluène-acétonitrile). Cepen-dant, le couplage demeure un échec probablement à cause de la complexation du palladium par les atomes d’azotes des hétérocycles pyridine, pyrimidine et pyridazine.

La nouvelle approche consiste à utiliser une condensation de Claisen pour permettre la for-mation d’une β-dicétone intermédiaire fonctionnalisée par les groupements pyridine, pyrimi-dine ou pyridazine. L’ajout d’hydrazine monohydrate sur la β-dicétone intermédiaire permet la formation in situ du pyrazole par cyclocondensation.154 Les synthèses des composés LCPK23, 25 et 26 sont représentées dans le schéma 88. Les produits de départ phénylacétone 17 et méthyl

pyrimidine 18 ont été synthétisés en amont.

153 Stonehouse, J.P. et al. Synlett. 2008, 1, 0100-0104

Chapitre 4 : Pyrazoles

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Schéma 88 : Synthèse de LCPK23, LCPK25 et LCPK26

Réactifs et conditions : (a) (COCl)2, DMSO, NEt3, DCM anhydre, -78°C - TA, 18h (b) NaH, THF an-hydre, reflux, 18h (c) N2H4.H2O, TA, 18h (d) SOCl2, MeOH, reflux, 18h (c) NaH, THF anhydre, reflux, 18h

De manière générale, la condensation de Claisen en présence d’une base forte et d’un solvant polaire aprotique permet de former la liaison carbone-carbone entre le dérivé carbonyle phény-lacétone 17 et les divers esters méthyliques, pyridine, pyrimidine ou pyridazine, pour donner la

Chapitre 4 : Pyrazoles

142 β-dicétone intermédiaire.155 L’utilisation d’une base forte tel que l’hydrure de sodium NaH (pKa 35) au lieu de l’éthoxide de sodium NaOEt (pKa 15.5) permet souvent d’augmenter les rendements en favorisant la déprotonation de l’atome de carbone en position β de la cétone (pKa 25). Ainsi le carbanion généré provoque une attaque nucléophile sur l’atome de carbone électrophile en α de l’ester, ce qui engendre la formation d’une β-dicétone et la libération de méthoxide de sodium. Un solvant polaire aprotique, comme le THF, permet une bonne sépara-tion des charges dans le milieu ce qui stimule la réacsépara-tion sans favoriser la formasépara-tion de liaisons hydrogène. Enfin l’ajout au milieu d’hydrazine monohydrate permet de former in situ, à partir de la dicétone intermédiaire, le pyrazole afin de générer les divers composés finaux LCPK23, 25 et 26 avec des rendements de 20 à 46%.

Cependant, la phénylacétone 17 a été synthétisée en amont pour toutes les synthèses. En effet,

cette molécule est connue pour être un précurseur de méthamphétamine et d’amphétamine ce qui fait d’elle une substance contrôlée et couteuse. Le composé 17 a donc été obtenu par

oxy-dation de Swern du phénylpropanol E commercial, en présence de chlorure d’oxalyle, de

DMSO et de triéthylamine (schémas 88).156

De même, la méthyl pyrimidine-4-carboxylate 18 a été synthétisée à partir de l’acide

pyrimi-dine-4-carboxylique F par méthylation de la fonction acide carboxylique en présence de

chlo-rure de thionyle SOCl2 et de méthanol.157 L’acide carboxylique est converti en ester méthylique après activation sous forme de chlorure d’acide (schéma 88).

155 (a) Yu, X. et al. Synthesis 2014, 46, 2422-2429 (b) Royals, E. E. J. Am. Chem. Soc. 1948, 70, 489–491

156Omura, K.; Swern, D. Tetrahedron 1978, 34, 1651

Chapitre 4 : Pyrazoles

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IV. Conclusion

La recherche de nouveaux inhibiteurs de DNMT1 a permis d’identifier les composés pyrazoles par modélisation moléculaire, représentés dans le schéma 89. Leur activité inhibitrice

in vitro sera présentée dans le Chapitre 5.

Schéma 89 : Composés pyrazoles

Les études de modélisation moléculaire montrent que ces composés après minimisation sont capables d’établir, grâce à la matrice pyrazole, différentes interactions stabilisantes (liaisons hydrogène, π-stacking, interaction C-H/π) avec les acides aminés du site actif de la DNMT1. En effet le cycle, facilement fonctionnalisable en position 3 et 5, permet de jouer comme la proline le rôle de répartiteur de fonctions en projetant les divers substituants dans les deux poches de la DNMT1. Le pyrazole apparaît d’autant plus comme une matrice intéressante pour la synthèse de nouveaux inhibiteurs qu’elle autorise, grâce aux deux atomes d’azotes, la mise en place de liaison hydrogène proches de celles établies par les groupements hydroxyles du ribose du SAM, contrairement au cycle pyrrolidine. Ces nouvelles interactions stabilisantes sont susceptibles d’améliorer l’affinité de ces composés pour l’enzyme.

Enfin, l’étude conformationnelle met en évidence le fait que leur conformation minimisée dans le site actif, c’est-à-dire leur conformation de plus basse énergie dans un espace contraint qui est le site actif, est proche de leur conformère dans le vide (libre). En d’autres termes les con-formations, théorique (contrainte dans le site actif) et bioactive (libre), sont proches l’une de l’autre. Ainsi, leur conformation théorique modélisée dans le site actif semble plus réaliste par rapport aux prolino-homo-tryptophanes car cette dernière est moins coûteuse en énergie. Par ailleurs, deux stratégies de synthèse ont été mises en place impliquant toutes deux la for-mation du cycle pyrazole in situ en présence d’hydrazine. Dans un premier cas, la liaison car-bone-carbone entre les divers substituants et le cycle aromatique est permise par un couplage de Sonogashira. Dans un second temps, c’est une condensation de Claisen qui a été adoptée.

Chapitre 4 : Pyrazoles

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L’évaluation biochimique des composés prolino-homo-tryptophanes et pyrazoles ainsi que leur capacité à inhiber l’activité de la DNMT1 est présentée dans le Chapitre 5.

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