Analogues contraints de 1 ère génération

Les interactions non covalentes (interactions électrostatiques, hydrophobes, de Van der Waals, liaisons hydrogène) participent à l’affinité et à la spécificité d’un substrat pour son en-zyme. C’est pourquoi la recherche s’est d’abord focalisée sur l’optimisation de ces dernières dans le but d’obtenir des molécules thérapeutiques plus puissantes. En effet, pendant longtemps les molécules portant des groupements réactifs ont souvent été mises de côté dans la crainte qu’elles soient peu spécifiques et que cela induise une toxicité.125 Même si le développement d’inhibiteurs covalents a été considérablement ralenti, aujourd’hui près de 30% des inhibiteurs enzymatiques sur le marché agissent comme des inhibiteurs covalents, tels que le Lansoprazole

Chapitre 3 : Les prolino-homo-tryptophanes

94 ou encore l’Aspirine.126 La plupart des protéines portent un grand nombre de résidus nucléo-philes, tels que les résidus sérine, cystéine, lysine entre autres, propices à leur réaction avec des entités électrophiles comme des accepteurs de Michael, des époxydes, des nitriles, ou des β lactames par exemple. En outre, on trouve déjà ces fonctions dans de nombreuses molécules naturelles.127 Ainsi, ce travail de thèse s’est concentré, dans un premier temps, sur la mise au point de molécules capables de cibler le résidu cystéine catalytique de la DNMT1 dans le but de former une liaison covalente. Leur conception par modélisation moléculaire ainsi que leur synthèse chimique sont décrites dans les sections suivantes.

II.1. Modélisation moléculaire

Comme décrit dans le Chapitre 2 (partie II.1) la proline existe sous différentes formes rotamériques. La nouvelle modélisation des composés de références 16 et 17 dans le logiciel

MOE a permis de définir, en corrélation avec une étude RMN NOESY, la structure du cycle pyrrolidine la plus adéquate pour le design de nouveaux analogues. Ainsi le cycle pyrrolidique adopte-il une conformation Cγ endo dite « puckering up » où l’indole est en équatorial et la liaison amide majoritairement trans à 80%. De même, parmi les deux énantiomères (2S/3R) et (2R/3S) synthétisés à l’origine, c’est le (2R/3S) qui semble le plus pertinent et qui sera adopté pour la synthèse des nouveaux composés. A partir du fichier de référence contenant la molécule

17 (2R/3S), notre travail s’est focalisé sur le cycle aromatique qui se projette dans la poche du

substrat ADN (schéma 44).

126 Robertson, J. G. Biochemistry 2005, 44, 5561-5571

127 De Cesco, S.; Kurian, J.; Dufresne, C.; Mittermaier, A. K.; Moitessier, N. European Journal of Medicinal

Chapitre 3 : Les prolino-homo-tryptophanes

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Schéma 44 : Fichier de référence molécule 17 (code PDB 4DA4)

L’étude de modélisation moléculaire a permis de concevoir quatre analogues contraints de pre-mière génération (schéma 45). Pour cela diverses fonctions électrophiles ont été introduites en

position méta du phényl car cette position est la plus proche du résidu cystéine catalytique (schéma 46).

Chapitre 3 : Les prolino-homo-tryptophanes

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Schéma 46 : Exemple de la modélisation et des interactions dans le site actif de la DNMT1 de A) LCPK13 (vert) B) LCPK15 (vert) superposé au SAM (bleu)

Chapitre 3 : Les prolino-homo-tryptophanes

97 Les fonctions vinyles, nitriles ou encore acrylamide sont connues pour être réactives face aux groupements thiols de résidus cystéines et sont présentes dans de nombreux inhibiteurs cova-lents.128 Par ailleurs, l’indole de tous ces analogues se superpose parfaitement avec la fonction adénine du SAM. Enfin, de nombreuses liaisons hydrogène s’établissent entre les diverses fonc-tions chimiques des composés et les acides aminés du site actif. Ces interacfonc-tions favorables pourraient jouer un rôle dans l’affinité de la molécule pour sa cible.

Ainsi, l’acide carboxylique de LCPK13 établit, comme le composé LCPK12, deux liaisons

hydrogène avec les chaînes latérales des résidus lysine Lys 1247 et glutamine Gln 1230. A ces dernières s’ajoute celle qu’effectue le carboxyle de la liaison amide avec la fonction guanidi-nium de l’arginine Arg 1576. Une autre interaction de type CH/π s’établit entre le phényle et la chaîne latérale du résidu asparagine Asn 1580. Quant au nitrile il se place proche du résidu cystéine catalytique Cys 1229 au point de former deux nouvelles liaisons hydrogène, l’une avec l’amine et l’autre avec la fonction thiol. Contrairement à LCPK13, le composé LCPK14

n’éta-blit aucune liaison hydrogène au niveau de sa fonction nitrile et présente peu d’interactions stabilisantes autres que celles établies entre son acide carboxylique et les chaînes latérales des résidus lysine Lys 1247 et glutamine Gln 1230. Enfin, le composé LCPK15 présente aussi

quelques liaisons hydrogène favorables notamment entre l’acide carboxylique et les chaînes latérales des résidus lysine Lys 1247 et glutamine Gln 1230. Le carboxyle de la liaison amide établit une autre liaison hydrogène avec l’amide du résidu asparagine Asn 1580. L’acrylamide se projette vers la Cys 1229 où son atome d’azote établit une liaison hydrogène avec le thiol du résidu cystéine. On note aussi que la distance interatomique entre le CH2 de l’acrylamide et la Cys 1229 est satisfaisante, de l’ordre de 2.16 Å. Une liaison hydrogène varie entre 1.2 et 3.2 Å mais idéalement elle se situe entre 1.5 et 2.2 Å.

Parmi les fonctions électrophiles certaines ont un positionnement favorable dans la poche en-zymatique puisqu’elles se trouvent suffisamment proche du résidu cystéine catalytique pour permettre une réaction.

128 (a) Silkos, M.; BenAissa, M.; Thatcher, G. R. J. Acta Pharmaceutica Sinica B 2015, 5, 506-519 (b) De Cesco,

S.; Kurian, J.; Dufresne, C.; Mittermaier, A. K.; Moitessier, N. European Journal of Medicinal Chemistry 2017,

Chapitre 3 : Les prolino-homo-tryptophanes

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II.2. Résultats et discussion

Dans un premier temps les énantiomères (2S/3R) et (2R/3S) des composés 16 et 17

(Guianvarc’h J. Med. Chem. 2014) ont été synthétisés afin de servir de référence lors de

l’éva-luation biochimique finale. Par ailleurs, dès à présent ces molécules 16 et 17 sont renommées

respectivement LCPK5 et LCPK6. Toutefois, tous les nouveaux composés finaux seront

uni-quement sous forme (2R/3S). La synthèse du squelette prolino-tryptophane découle d’une mé-thodologie mise en place au laboratoire et qui inclus une réaction de carbocyclisation suivie d’un couplage de Negishi.129 D’une part, la carbocyclisation est cruciale pour former le cycle pyrrolidine de la proline et assurer une conformation syn des substituants indoles et acides car-boxyliques. D’autre part, le couplage de Negishi permet d’introduire l’indole qui correspond à la partie tryptophane de la molécule. Enfin, la formation d’une liaison amide entre la proline et différents acides substitués en méta se fait en deux étapes via un intermédiaire halogénure d’acyle.

La synthèse des composés de référence LCPK5 et LCPK6, ainsi que celle des inhibiteurs

sui-cides LCPK12-15, est représentée dans le schéma 47.

129 (a) Mothes, C.; Lavielle, S.; Karoyan, P. J. Org. Chem. 2008, 73, 6706-6710 (b) Quancard, J.; Labonne, A.;

Jacquot, Y.; Chassaing, G.; Laville, S.; Karoyan, P. J. Org. Chem. 2004, 69, 7940-7948 (c) Karoyan, P.; Chassaing,

Chapitre 3 : Les prolino-homo-tryptophanes

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Schéma 47 : Synthèse des composés LCPK5 - 15

Réactifs et conditions : (a) 4-bromobutène, NaI, K2CO3, DMF anhydre, 60°C, 18h (b) 2-benzylbromoa-cetate, Na2CO3, acétone, TA, 16h (c) LDA, ZnBr2 anhydre, Et2O distillé, -78°C, 2h (d) I2, KOH, MeOH / H2O (5 : 1), TA, 2h (e) Boc2O, NEt3, DMAP, DCM, TA, 72h (f) tert-butyl 3-iodo-1H-indole-1-car-boxylate 6, Pd(OAc)2 , tBu3P-HBF4, THF anhydre, TA, 18h (g) H2 Pd/C 10%wt, MeOH, TA, 1h (h) chlorure d’acide, NaOH 1M, THF, 0°C puis TA, 16-18h (i) TFA, TIS ou H2O, DCM, TA.

La (R)-α-méthyl-benzylamine 1 énantiopure et commerciale est alkylée dans un premier temps

par le bromobutène en conditions basiques pour donner 2.130 La copule chirale présente au ni-veau de l’azote est indispensable pour contrôler les configurations absolues des carbones asy-métriques et assurer une synthèse énantiosélective. Ainsi à partir de la (R)-α-méthyl-benzyla-mine on obtient des prolines substituées en position 3 avec une configuration absolue 2R. L’amine tertiaire 3 nécessaire à la carbocyclisation est formée par ajout du benzylbromoacétate

à partir de 2.131 Par ailleurs, le tert-butyl 3-iodo-1H-indole-1-carboxylate 6 est formé à partir de

130 Karoyan, P.; Chassaing, G. Tetrahedron Asymmetry 1997, 8, 2025-2032

Chapitre 3 : Les prolino-homo-tryptophanes

100 l’indole commercial par iodation en milieu basique puis protection Boc de l’azote dans des conditions classiques.132 La protection de l’indole est nécessaire au couplage de Negishi puisque le caractère électroattracteur du groupement tert-butoxyarbonyle favorise l’étape d’ad-dition oxydante.133 La carbocyclisation de l’amine tertiaire 3 permet de former l’intermédiaire

zincique qui réagit par la suite avec le noyau indole 6 via un couplage de Negishi pour former

le composé 7.

La carbocyclisation à partir de l’α-amino-ester 3 est réalisée, dans un premier temps, par

dépro-tonation par le LDA du proton en α de l’ester benzylique, suivie par une transmétalation pour former l’énolate de zinc. Sous atmosphère inerte et parfaitement anhydre, la cyclisation intra-moléculaire donne un intermédiaire zincique. Cette étape est fondamentale dans le contrôle de la stéréochimie syn en accord avec l’auxiliaire chirale de l’amine tertiaire 3. Le sel de

trialkyl-phosphonium utilisé comme phosphine pour le couplage présente l’avantage d’être stable à l’air, peu coûteux, et permet d’éviter la β-élimination en compétition avec l’élimination réduc-trice.134

Ensuite, l’hydrogénation catalytique du composé 7 en présence de Pd/C permet d’éliminer en

une étape la copule chirale et le groupement benzyle pour donner le prolino-homo-tryptophane déprotégé 8. Ce dernier servira de produit de départ pour la synthèse de toutes les générations

de prolino-homo-tryptophanes.

Enfin, les produits finaux LCPK5 – 15 sont obtenu par réaction du composé 8 avec les

chlo-rures d’acides de chaque acide correspondant en conditions aqueuses basiques biphasiques de type Schotten-Baumann,135 suivie de la déprotection Boc de l’indole en conditions acides en présence de TIS ou d’eau afin de piéger le carbocation tert-butyle libéré.

La structure totalement déprotégée du composé 8 ne permettait pas en premier lieu d’utiliser

des agents de couplage pour activer l’acide à greffer et faire le couplage peptidique. C’est pour-quoi la stratégie chlorure d’acide a tout d’abord été adoptée, les chlorures étant commerciaux ou formés à part puis ajoutés au milieu réactionnel en présence de la proline 8. La formation

des chlorures d’acides se fait dans les conditions classiques à température ambiante et sous

132 Witulski, B.; Buschmann, N.; Bergsträsser, U. Tetrahedron 2000, 56, 8473

133 Mothes, C.; Lavielle, S.; Karoyan, P. J. Org. Chem. 2008, 73, 6706-6710

134 Netherton, M. R.; Fu, G. C. Org. Lett. 2001, 3, 4295-4298

135 (a) Schotten, C. Ber. Dtsch. Chem. Ges. 1884, 17, 2544–2547 (b) Baumann, E. Ber. Dtsch. Chem. Ges. 1886,

Chapitre 3 : Les prolino-homo-tryptophanes

101 argon en présence de chlorure de thionyle et d’une quantité catalytique de DMF pour former le sel de Vilsmeier qui augmente la vitesse de réaction.

Tout d’abord, une première méthode de couplage entre les chlorures d’acyle et le composé 8,

suivant les conditions décrites dans la publication d’origine pour la synthèse des composés

LCPK5 (16 dans la publication) et LCPK6 (17 dans la publication), avait été testée en utilisant

les chlorures de naphthoyl et de benzoyl respectivement, en présence de triéthylamine dans le DCM et à température ambiante. Toutefois, la formation d’anhydrides au niveau de l’acide carboxylique de la proline 8 avait été observée dans ces conditions. C’est la raison pour laquelle

une nouvelle stratégie de synthèse permettant d’éviter la formation de ce sous-produit a été développée. Dans cette nouvelle méthode de couplage, le chlorure d’acide est ajouté à froid sur la proline 8 en solution dans les conditions de Schotten-Baumann en présence de soude aqueuse

1M et de THF, qui forment un milieu aqueux basique et bi-phasique. L’ajout à froid ainsi que le milieu basique aqueux (pH > 10) permet d’éviter la formation des anhydrides et de contrôler la sélectivité de l’acylation sur l’azote. Le solvant THF a été choisi ici car il possède la propriété d’être miscible à l’eau.

Par ailleurs, les acides nécessaires à la synthèse des composés LCPK5-14 sont commerciaux

(acides naphthoïque, benzoïque, vinylbenzoïque, cyanobenzoïque, cyanomethylbenzoïque res-pectivement) à l’exception de celui nécessaire à la synthèse de LCPK15. L’acide

3-acrylami-dobenzoïque 9 a donc été synthétisé selon le schéma suivant (schéma 48).136

Schéma 48 : Synthèse de l’acide 3-acrylamidobenzoïque (9)

Réactifs et conditions : (a) chlorure d’acryloyle, EtN(iPr)2, DCM, 0°C, 2h (b) LiOH.H2O, acétonitrile / H2O (1 : 1), TA, 1h

Le méthyl 3-aminobenzoate A commercial est d’abord acylé avec du chlorure d’acryloyle en

conditions basiques à froid dans le but de contrôler la réactivité. Enfin, la lithine monohydrate permet l’hydrolyse de l’ester méthylique pour former l’acide nécessaire à la formation de la liaison amide avec l’azote libre de la proline 8.

Chapitre 3 : Les prolino-homo-tryptophanes

102 De plus, même si seule la synthèse des énantiomères (2R/3S) est montrée ici, les énantiomères (2S/3R) des références notés (S)-LCPK5-6 ont été synthétisés en utilisant la même voie de

synthèse décrite au schéma 47 mais à partir de la (S)-α-méthyl-benzylamine énantiopure, qui

donne donc des prolines substituées avec une configuration absolue (2S).

La recherche d’analogues contraints de première génération s’est focalisée sur des pro-duits portant des fonctions susceptibles de réagir avec le résidu cystéine catalytique et donc d’agir comme inhibiteurs suicides. A présent, c’est la deuxième stratégie qui sera explorée avec la présentation de la modélisation puis de la synthèse des mimes de SAM.